楊春林，李佳峻，胡 強，吳 蔚，蒙 輝，彭燈水

（1.樂山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所食品化工中心，四川樂山 614000；2.上海海豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，上海202179；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川雅安 625014）

基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測定川味香腸中的蘇丹紅染料

楊春林1，李佳峻1，胡 強1，吳 蔚1，蒙 輝2，彭燈水3

（1.樂山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所食品化工中心，四川樂山 614000；2.上海海豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，上海202179；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川雅安 625014）

建立了川味香腸中蘇丹紅I～IV的基質(zhì)固相分散（MSPD）-高效液相色譜（HPLC）分析方法。樣品以無水硫酸鈉作為分散基體，研磨均勻后與中性氧化鋁同時裝柱，正己烷淋洗凈化，以丙酮-正己烷（5∶95，V/V）溶液洗脫。用Inertsil ODS-sp C18柱（4.6mm×250mm，5μm）進行分離，流動相A為含0.1%甲酸的甲醇，流動相B為0.02mol/L的乙酸銨溶液（A∶B= 85∶15，V/V），等度洗脫，柱溫40℃。二極管陣列檢測器檢測，檢測波長為490nm，利用保留時間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量。4種蘇丹紅染料在0.10～50.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，蘇丹紅I、II、III、IV的檢出限（LOD）分別為0.008～0.011mg/kg（信噪比S/N=3）。在添加濃度為5.0～25.0mg/kg范圍內(nèi)平均回收率達85.54%～94.66%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.87%～4.23%（n=6）。

川味香腸，蘇丹紅I～IV，高效液相色譜，基質(zhì)固相分散

蘇丹紅（Sudan Dyes）屬于偶氮類化工染色劑，主要用于為溶劑、油、蠟、汽油增色以及鞋、地板等的增光以及生化毒理學(xué)研究中的著色等[1-3]。據(jù)英國聯(lián)邦危險品管理局測試，長期低量攝入蘇丹紅可能致癌[4]。研究表明，蘇丹紅本身不會對人體產(chǎn)生有害的影響，但它可以被還原降解為對人體具有強烈的致癌作用的芳香胺類化合物[5]。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將蘇丹紅歸為三類致癌物，包括我國在內(nèi)的許多國家都明令禁止將其作為色素添加劑在食品和飼料中使用[6]。由于蘇丹紅顏色鮮艷、不易褪色并具有油溶性的特點，不法分子使用含蘇丹紅的辣椒作為川味香腸的調(diào)味料或直接用蘇丹紅代替紅曲紅天然色素給香腸上色，以降低生產(chǎn)成本，獲得高額利潤。所以建立有效的檢測川味香腸中蘇丹紅的方法具有重要的意義。目前，食品中蘇丹紅染料的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、氣質(zhì)聯(lián)用法[13]、分光光度法[14]、熒光光譜法[15]、共振光散射法[16]以及酶聯(lián)免疫檢測法等[17]，常用的前處理技術(shù)主要包括溶劑萃取法（SE）、固相萃取法（SPE）、固相微萃取技術(shù)（SPME）等。我國頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法[18]采用正己烷提取，中性氧化鋁柱凈化，該方法對辣椒面等含油脂和水分較少的樣品提取和凈化效果較好，回收率和靈敏度很高?；|(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）[19]集合了傳統(tǒng)的樣品均質(zhì)、提取、過濾、凈化等過程，使樣品的前處理簡便快捷，減少有機溶劑的使用量，大大提高傳統(tǒng)提取方法不易分散的樣品的回收率，該技術(shù)已廣泛用于動物組織和水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留的分析[20]。川味香腸含油脂和動物蛋白較多，不易分散，實驗采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法來提取川味香腸中的蘇丹紅，用高效液相色譜—二極管陣列檢測器進行檢測，并優(yōu)化前處理技術(shù)和色譜條件，建立川味香腸中蘇丹紅I～IV的基質(zhì)固相分散—高效液相色譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色譜純） 美國Tedia公司；乙醚、甲酸、乙酸銨、無水硫酸鈉（500℃烘烤3h） 成都市科龍化工試劑廠；層析用中性氧化鋁（100～200目） 上海陸都化學(xué)試劑廠。

高效液相色譜儀LC-20A（配置四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)、自動進樣系統(tǒng)、光電二極管陣列檢測器） 日本SHIMADZU公司；氮吹儀N-EVAP 美國Organomation公司；電子天平DV215CD（精確至0.00001g） 美國Ohaus公司；純水機 四川沃特爾科技有限公司；超聲波清洗器 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-sp C18（4.6mm× 250mm，5μm）；流動相：含0.1%甲酸的甲醇+0.02mol/L的乙酸銨溶液（85∶15，V/V），使用前過0.45μm濾膜；柱溫：40℃，流速：1.0m L/m in，等度洗脫；檢測波長為490nm。

1.2.2 中性氧化鋁制備 稱取在200℃下烘烤2h的中性氧化鋁100g，加入1.8m L水，混勻后密封備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制 準(zhǔn)確稱取蘇丹紅I、II、III、IV標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確至0.01mg），用乙醚溶解并用丙酮稀釋成濃度為1mg/m L的儲備液。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量用丙酮稀釋定容成濃度為0.10、0.50、1.25、5.00、10.00、25.00、 50.00μg/m L的工作溶液，取20μL進樣測定峰面積，以質(zhì)量濃度對峰面積作曲線。

1.2.4 樣品處理及測定 取有代表性的川味香腸切細后勻漿，準(zhǔn)確稱取5g試樣于100m L研缽中，加入5g無水硫酸鈉，研磨均勻備用。取20cm×2cm玻璃層析柱，在其底部墊一層薄薄的脫脂棉，以干法裝入制備好的中性氧化鋁至約3cm高，輕輕敲擊使填實后用10m L正己烷預(yù)淋洗；加入研磨好的均勻樣品，輕輕敲實后于上部塞一層薄薄的脫脂棉，架于鐵架臺上。用20～30m L正己烷淋洗至無色，棄淋洗液，用50m L含5%丙酮的正己烷洗脫，收集洗脫液于塑料離心管中，氮吹儀濃縮至近干，用丙酮準(zhǔn)確定容至5m L，0.45μm有機濾膜過濾后進行液相色譜分析，以保留時間結(jié)合光譜圖定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

將蘇丹紅I～IV號標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進行色譜分離并用二極管陣列檢測器在波長200～550nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，光譜圖見圖1。結(jié)果表明，在該方法儀器條件下四種蘇丹紅染料均在480～520nm波長范圍內(nèi)有最大吸收，其中蘇丹紅I和蘇丹紅II的最大吸收波長小于500nm，分別為476nm和495nm，蘇丹紅III和蘇丹紅IV的最大吸收波長大于500nm，為506nm和516nm。國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T19681－2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法—高效液相色譜法》）采用的檢測波長為500nm，在該波長條件下，蘇丹紅I～IV號均有較高的響應(yīng)值，但是川味香腸實際樣品的測定中發(fā)現(xiàn)，在500nm波長下蘇丹紅III和蘇丹紅IV色譜峰之間的干擾較多，通過篩選驗證，選擇490nm為蘇丹紅I～IV號的檢測波長。

圖1 蘇丹紅I～IV紫外可見掃描光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra of Sudan I～IV

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

在國家標(biāo)準(zhǔn)方法中，采用溶劑A：0.1%甲酸的水溶液∶乙腈=85∶15，溶劑B：0.1%甲酸的乙腈溶液∶丙酮=80∶20作為流動相，梯度洗脫。該方法大量使用乙腈、丙酮等高毒試劑，危害操作人員的身體健康，對環(huán)境很不友好。并且由于該方法采用梯度洗脫，在第10min有機相從75%改變至100%，為了平衡基線以進行下一個樣品的分析，第32m in開始有機相又從100%變換到75%，所以分析過程的后半段基線的波動較大（圖2A），對蘇丹紅III特別是蘇丹紅IV的準(zhǔn)確定量造成一定的困難，并且從一個樣品開始分析到下一個樣品進樣需要50m in甚至更長的時間。實驗分別采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-硫酸銨水溶液和甲醇-硫酸銨水溶液作為流動相做等度洗脫，均不能將四種蘇丹紅完全分離；用酸性甲醇-水溶液能將目標(biāo)物質(zhì)分離，但是蘇丹紅IV色譜峰拖尾嚴重，在水溶液中加入0.02mmol/L的乙酸銨等度洗脫不但分離完全，并且峰型尖銳對稱（圖2B）。本方法采用等度洗脫將4種蘇丹紅完全分離，與國標(biāo)方法相比四個目標(biāo)物的出峰時間稍有提前，并且由于基線平穩(wěn)，進樣后25m in即可進行下一個樣品的分析，大大縮短分析時間，提高工作效率，定量更加準(zhǔn)確。

圖2 蘇丹紅I～IV標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard solution of Sudan I～IV

2.3 樣品前處理優(yōu)化及測定

2.3.1 基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法 香腸中含有大量的油脂和動物蛋白，而蘇丹紅又是油溶性的物質(zhì)，在提取過程中由于樣品中一部分動物蛋白變性后與油脂一起作用，將蘇丹紅包裹起來，用有機溶劑直接提取不能有效分散樣品，提取率較低。按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法用正己烷從香腸中提取蘇丹紅，濃縮后過中性氧化鋁柱，由于大量油脂的集中過柱，影響中性氧化鋁對蘇丹紅的吸附，加標(biāo)回收率很低，其中蘇丹紅III的平均加標(biāo)回收率只有40%左右。本實驗針對肉制品的特點，采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法，用無水硫酸鈉與樣品一起研磨后再與中性氧化鋁一起裝柱，達到分散樣品的目的，使提取溶劑與樣品充分接觸。由于樣品沒有濃縮，油脂分散進入氧化鋁柱，對氧化鋁活性影響較??；加入無水硫酸鈉還可以消除香腸中水分對氧化鋁吸附活性的影響，提高樣品回收率。

自制的層析柱的分離效果受多方面因素的影響，對操作技術(shù)的要求較高，在裝填層析柱時應(yīng)輕輕敲擊管柱，使層析柱中的填充物裝填結(jié)實，不能有縫隙，否則在層析的過程中會因淋洗液的作用形成斷層或氣泡，嚴重影響層析效果；在淋洗的過程中，應(yīng)盡量使淋洗液順著層析柱的管壁緩緩注入，避免破壞層析柱表面層的平整，使層析過程均勻連續(xù)，保證層析的效果。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液及樣品定容溶劑的選擇 在高效液相色譜（HPLC）分析中，樣品的極性和進樣的體積對色譜峰的峰型和保留時間有一定的影響。國家標(biāo)準(zhǔn)方法用正己烷定容標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，但是在樣品的處理過程中采用丙酮定容后進行液相色譜分析，由于溶劑的不統(tǒng)一，導(dǎo)致樣品目標(biāo)峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰保留時間有差異；在本方法的儀器條件下，進樣量20μL，加標(biāo)樣品中蘇丹紅II和蘇丹紅III的保留時間比標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間推遲1min以上（圖3A、B）；在主要以保留時間定性的HPLC分析中，這種差異是致命的?？紤]與流動相的互溶以保證結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，本方法對蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液均采用丙酮定容，所得目標(biāo)峰的峰型尖銳對稱，保留時間重現(xiàn)性好（圖3C、D），定性準(zhǔn)確。由圖3還可以看出，實驗采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法處理的樣品非常干凈，對目標(biāo)峰無干擾，完全滿足HPLC分析的要求。

圖3 兩種方法標(biāo)準(zhǔn)溶液與加標(biāo)樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard solution and spiked samples of the twomethods

2.3.3 氧化鋁的活性及洗脫體積的確定 由于中性氧化鋁對蘇丹紅的吸附活性是由含水量的多少決定的，一般先對中性氧化鋁進行烘烤脫水活化，再加入一定量的水使其失活來控制中性氧化鋁的活性。以含5%丙酮的正己烷50m L為洗脫液，測定不同含水條件下中性氧化鋁凈化加標(biāo)樣品的回收率。實驗表明，當(dāng)100g中性氧化鋁中含水量低于1.5m L時，氧化鋁活性太高，蘇丹紅I和蘇丹紅III不能完全洗脫，回收率較低；當(dāng)100g中性氧化鋁中含水量高于2.5m L時，氧化鋁活性太低，對蘇丹紅的吸附力不夠，用正己烷淋洗時部分蘇丹紅II和蘇丹紅IV就被洗脫下來，在收集的20m L淋洗液中測得蘇丹紅II和蘇丹紅IV約為加標(biāo)量的40%～50%。經(jīng)過多次調(diào)整和測定，最后確定在100g活化的中性氧化鋁中加入1.8m L，所得的4種蘇丹紅回收率都較高。在此基礎(chǔ)上，采用含5%丙酮的正己烷對加標(biāo)樣品進行洗脫，收集洗脫液，每5m L洗脫液收集一次，當(dāng)收集的洗脫液總量在50m L以后，洗脫液中不含蘇丹紅，故洗脫液體積確定為50m L。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

以質(zhì)量濃度-峰面積做校正曲線，得到線性回歸方程，4種蘇丹紅染料在0.10～50.00μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性方程見表1。以3倍信噪比為檢出限（LOD），計算得出蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的檢出限分別為0.008～0.011mg/kg。以10倍信噪比為定量限（LOQ），計算出蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ定量限分別為0.025～0.033mg/kg。

表1 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1 Standard curves，limitof detection，and limit of quantification for SudanⅠ～Ⅳ

2.5 方法的回收率和精密度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對川味香腸中蘇丹紅染料進行3個濃度的加標(biāo)回收實驗，每個濃度重復(fù)6次。由表2可見，4種蘇丹紅染料在添加濃度為5.0～25.0mg/kg范圍內(nèi)平均回收率為85.54%～94.66%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～4.23%，完全滿足食品分析的要求。其中，蘇丹紅Ⅰ的回收率最高，在5.0mg/kg的低濃度添加水平下平均回收率仍可達90.54%。蘇丹紅Ⅳ的平均回收率相對較低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差稍大，這是因為蘇丹紅Ⅳ的色譜峰峰型較寬，靈敏度偏低，特別是物質(zhì)含量很低的情況下，在定量上不夠精確。

2.6 樣品測定

對市區(qū)的大中型超市和農(nóng)貿(mào)市場的川味香腸進行抽檢，分別按照上述方法進行處理，通過保留時間和光譜圖定性，未發(fā)現(xiàn)蘇丹紅陽性樣品。

3 結(jié)論

建立了川味香腸中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的高效液相色譜分析方法。實驗采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法對樣品進行凈化處理，高效液相色譜—二極管陣列檢測器進行檢測，利用光譜圖和保留時間雙重定性增加了方法的可靠性。與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，減少了超聲提取、過柱前的濃縮等操作步驟；由于簡化了流動相并采用等度洗脫方式，基線平穩(wěn)，所以定量更加準(zhǔn)確，在縮短分析時間的同時減少有毒試劑的使用和排放。此方法簡便、快速、可靠，重現(xiàn)性好，可用于川味香腸中蘇丹紅染料含量的測定。

表2 蘇丹紅在川味香腸中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of Sudan in Sichuan sausage（n=6）

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Determ ination of Sudan dyes in Sichuan sausage by combination of matrix solid-phase dispersion and high performance liquid chromatography

YANG Chun-lin1，LI Jia-jun1，HU Qiang1，WUW ei1，MENG Hui2，PENG Deng-shui3
（1.Center of Food and Chemical Product，Leshan Quality Supervising&Inspection Bureau，Leshan 614000，China；2.Shanghai Haifeng Modern Agricultural Co.，Ltd.，Shanghai202179，China；3.College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

A high-performance liquid chromatog raphy（HPLC）method combined w ith matrix solid-phase d ispersion（MSPD）was estab lished for determ ination of Sudan I～IV in Sichuan sausage.The sam p le was m ixed with anhyd rous sod ium sulfate to be a part of the chromatography column.The samp les were c leaned up w ith hexane and rinsed w ith 50m L of acetone-hexane（5∶95，V/V）.Separation was carried out on reversedphase InertsilODS-sp C18column（4.6mm×250mm，5μm）by using am ixture ofmethanoland form ic acid（999∶1）as mobile phase A，and 0.02mol/L ammonium acetate solution as mobile phase B（A∶B=85∶15，V/V）at a flow rate of 1.0m L/m in.Detec ted at the wavelength of 490nm by d iode array detector as the temperature was hold at 40℃.The retention time and spectra charac terization were both used to determ ine Sudan dyes and the content of Sudan dyes was quantified by external standard method.Sudan I～IV have good linearity in the range of 0.10～50.00μg/m L，the correlation coefficients were all above 0.9999 and the detection lim its of four Sudan dyes were 0.008～0.011mg/kg（S/N=3）.With the add ition of 5.0 to 25.0mg/kg of Sudan standard to sam p les，the average recovery rates of four Sudan dyes in Sichuan sausage were between 85.54%and 94.66%.The relative standard deviations（RSDs）of sp iked sam p les varied from 0.87%to 4.23%（n=6）.

Sichuan sausage；Sudan I～IV；high-performance liquid chromatog raphy；matrix solid-phase d ispersion

TS251.7

A

1002-0306（2012）09-0380-05

2011－08－11

楊春林（1982－），男，碩士，工程師，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制。