熊曼萍

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000）

超聲波-酶法提取艾葉多糖的條件研究

熊曼萍

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000）

以艾葉為原料，采用超聲波-酶法提取多糖。通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得最佳工藝條件為：料液比1∶40、超聲波提取時(shí)間30min、乙醇濃度80%，艾葉多糖提取率為0.790%。與超聲波法提取艾葉多糖相比，超聲波酶法艾葉多糖的實(shí)際得率提高56.75%。

艾葉，超聲波，酶，多糖，提取

艾葉是中醫(yī)常用藥之一，為菊科植物艾的干燥葉，藥用歷史悠久，始載見(jiàn)于《名醫(yī)別錄》，有散寒止痛，溫經(jīng)止血的功效，用于小腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕、吐血、衄血、崩漏經(jīng)多、妊娠下血以及外治皮膚瘙癢等癥[1]。雖然艾葉用于治病已經(jīng)有2000多年的歷史，但對(duì)艾葉的藥用成分進(jìn)行科學(xué)分析和利用，則始于近代。近年隨著化學(xué)成分以及藥理研究的深入，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。經(jīng)研究，艾葉的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、黃酮類、桉葉烷類、三萜類及多糖類等物質(zhì)[2]，具有抗菌、消炎、抗過(guò)敏、抗?jié)儭⒖顾ダ?、抗氧化、降血脂等多種生物活性[3-4]。因此，開(kāi)發(fā)我國(guó)艾葉資源有十分重要的意義。傳統(tǒng)的植物多糖提取方法多采用水提法，但提取率較低；近年來(lái)采用超聲波輔助提取方法大大提高了植物多糖的提取率，而采用超聲輔助酶法提取植物多糖取得了更好的效果[5-7]。目前對(duì)艾葉的研究很多，但對(duì)艾葉多糖的提取工藝研究較少。采用超聲波結(jié)合酶法提取艾葉多糖，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)艾葉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳工藝條件，為艾葉多糖的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾葉 宜春藥店購(gòu)買；纖維素酶（10000U/g） 山東隆大生物工程有限公司。

SK-2510HB超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；UV-2800AH型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；ZN-100高速中藥粉碎機(jī) 長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥廠；SHH.W 21.600型恒溫水箱 余姚市東方電工儀器廠；SKHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 艾葉在電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥24h，用手揉碎后，用粉碎機(jī)打成細(xì)粉末，過(guò)20目篩后裝入瓶中備用。

1.2.2 提取 準(zhǔn)確稱取艾葉1.0g置于250m L的三角瓶中，加蒸餾水搖勻，在50℃下加2.0%（對(duì)底物）[8]的纖維素酶處理2h后，59kHz超聲波，功率250W，在一定條件下處理一定時(shí)間，趁熱進(jìn)行抽濾，再向?yàn)V液中加入一定體積的無(wú)水乙醇，放置冰箱中靜置過(guò)夜，過(guò)濾得濾渣，將濾渣溶解定容至各個(gè)梯度，用蒽酮比色法測(cè)定樣品的吸光值，再計(jì)算出多糖提取率。

1.2.3 測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.010g，加蒸餾水溶解并定容至100m L，得濃度為0.1mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.20、0.30、040、0.60m L，分別加蒸餾水至1.0m L，充分搖勻后迅速置于冰浴中，加入10m L的蒽酮試劑后立即置于沸水浴中加熱7m in，取出放于冰浴中冷卻至室溫，用分光儀迅速測(cè)定620nm波長(zhǎng)下的吸光度，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程y=3.3719x+0.0041，（R2=0.9991）。

1.2.3.2 多糖的測(cè)定 采用蒽酮比色法[8-9]測(cè)定多糖。多糖提取率用以下公式計(jì)算：

艾葉粗多糖提取率（%）=（A×D×L/M）×100%

式中：A為吸光度，D為稀釋倍數(shù)，L為提取溶液體積，M為艾葉干粉質(zhì)量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、超聲波處理時(shí)間、料液比對(duì)艾葉多糖提取率影響的三個(gè)因素，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選擇三個(gè)水平，設(shè)計(jì)采用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響 艾葉中含單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿、氨基酸及醇溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)，由于多糖溶于水而不溶于高濃度乙醇，根據(jù)此原理和考慮到乙醇的成本問(wèn)題設(shè)定沉淀多糖的乙醇濃度梯度為70%、75%、80%、85%、90%。準(zhǔn)確稱取5份1g經(jīng)預(yù)處理的艾葉，料液比為1∶30，微波處理時(shí)間20m in，按1.2.2步驟操作，多糖提取液分別加入4倍濃度為70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液進(jìn)行多糖的沉淀，按1.2.3.2進(jìn)行多糖的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction of polysaccharides

由圖1可知，多糖的提取率隨著乙醇濃度的升高而逐漸升高。乙醇濃度為75%時(shí)提取率最高，之后隨著乙醇濃度的升高而逐漸降低。但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到90%時(shí)比其他濃度乙醇的提取率都低。因此并不是乙醇濃度越高對(duì)多糖的沉淀效果越好。因?yàn)楦邼舛纫掖伎赡艹恋砹艘恍┓嵌嗵穷愲s質(zhì)。

2.1.2 超聲波處理時(shí)間的影響 準(zhǔn)確稱取5份1g經(jīng)預(yù)處理的艾葉，料液比1∶30、乙醇濃度80%，按1.2.2步驟操作，分別用超聲波處理10、15、20、25、30m in，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on extraction of polysaccharides

由圖2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率顯著提高，但是超過(guò)一定時(shí)間（20m in）多糖提取速率大大下降。因此，超聲波處理時(shí)間應(yīng)在20min左右為宜。

2.1.3 料液比的影響 準(zhǔn)確稱取5份1g經(jīng)預(yù)處理的艾葉，按料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加入蒸餾水，按1.2.2步驟進(jìn)行后續(xù)處理，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ratio ofmaterial towater on extraction of polysaccharides

由圖3可知，隨著料液比的加大，艾葉中多糖的提取率也隨著增加；但當(dāng)料液比大于1∶30時(shí)，多糖的浸出速率明顯降低。雖然隨著料液比增加，多糖的提取率也隨之小幅增加，但是加入溶劑的量過(guò)大，會(huì)大大延長(zhǎng)后續(xù)處理時(shí)間以及生產(chǎn)成本，故料液比為1∶30～1∶40為宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平，進(jìn)行艾葉多糖提取的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析見(jiàn)表2。

從表2可知，影響多糖提取率的3個(gè)因素的極差R大小為：RC＞RA＞RB，即其影響能力大小為：乙醇濃度對(duì)多糖提取率影響最大，其次是料液比，最后是超聲波處理時(shí)間。最佳提取工藝條件為：A3B3C3，即料液比1∶40，超聲波處理時(shí)間30m in，乙醇濃度80%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取3份1.0g經(jīng)預(yù)處理的艾葉粉末，以正交實(shí)驗(yàn)最佳提取工藝條件：料液比1∶40，超聲波處理時(shí)間30m in，乙醇濃度80%，按1.2.2步驟操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。最佳提取工藝條件下艾葉多糖平均提取率為0.790%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of L9（33）orthogonal test

表3 最佳提取工藝條件下的多糖提取率Table 3 Extraction of polysaccharides that the optimal conditions by orthogonal test

2.4 超聲波-酶法與超聲波法的比較與分析

表4 兩種提取方法的結(jié)果比較Table 4 Comparison of the results of ultrasonic-enzyme extraction and ultrasonic extraction

由表4可以看出，利用超聲波-酶法可以明顯提高艾葉多糖的提取率，比單純的超聲波提取法提高了56.75%。

3 結(jié)論

3.1 在50℃加入2.0%（對(duì)底物）的纖維素酶處理2h條件下，提取艾葉多糖優(yōu)化的工藝條件為：料液比1∶40、超聲波處理時(shí)間30m in、乙醇濃度80%，艾葉多糖提取率達(dá)0.790%。由極差R看出影響艾葉多糖提取率的因素依次為：乙醇濃度＞料液比＞超聲波處理時(shí)間，乙醇濃度是影響超聲波酶法提取艾葉多糖提取率的最主要因素。

3.2 利用超聲波酶法可以明顯提高艾葉多糖的提取率，在最優(yōu)條件下其多糖提取率比單純的超聲波法提高了56.75%。

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Study on extraction conditions of polysaccharide from argy wormwood leaves by ultrasonic-assisted enzymetic methods

XIONG M an-ping

（Yichun University，College of Chemistry and Bioengineering，Key Laboratory of Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines，Yichun 336000，China）

Based on the orthogonal experiment，the op timum extraction cond itions of polysaccharides from argy wormwood leaves were obtained through ultrasonic-enzyme.The results showed that the op timum extraction conditions of polysaccharides were as follows：ratio of material solvent 1∶40，extraction solvent 80%ethanol concentration，ultrasonic extraction time 30m in.Under such cond ition，the extraction rate was up to 0.790%. Polysaccharides and ultrasonic extraction of the leaves compared to the ac tual yield of ultrasonic leaves polysaccharide inc reased 56.75%.

argy wormwood leaves；ultrasonic；enzyme；polysaccharides；extrac tion

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）09-0330-03

2011－08－09

熊曼萍（1963-），女，副教授，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品加工及天然活性成分的研究開(kāi)發(fā)。