逯城宇，張尊凱，劉 艷，張小蕾，張毅君，滕利榮，2，*

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012；2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東珠海 519041；3．新加坡國立大學(xué)理學(xué)院，新加坡肯特崗 118426）

蛹蟲草N102多糖提取條件優(yōu)化及其抗腫瘤活性研究

逯城宇1，張尊凱1，劉 艷1，張小蕾3，張毅君1，滕利榮1，2，*

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012；2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東珠海 519041；3．新加坡國立大學(xué)理學(xué)院，新加坡肯特崗 118426）

以蛹蟲草高產(chǎn)突變株N102的胞內(nèi)多糖為研究對象。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對蛹蟲草N102多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。蛹蟲草N102的菌絲體干粉經(jīng)乙醇除雜、水提、反復(fù)凍融、除蛋白、乙醇分級沉淀等方法得到三種多糖組分（2、4和6倍醇沉蛹蟲草N102多糖），并采用MTT法分別研究了蛹蟲草N102各級醇沉多糖對人宮頸癌細(xì)胞Hela體外增殖的影響。結(jié)果表明，蛹蟲草N102的最佳提取工藝為：提取溫度83℃，提取時間3.2h，水料比52∶1（mL∶g）。3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的蛹蟲草N102多糖提取率的平均值為7.24%，相對誤差為1.16%，可見該模型能較好地預(yù)測蛹蟲草N102多糖的提取工藝。蛹蟲草N102的4倍醇沉多糖（4FPS）對Hela細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)作用時間為72h時，抑制率可達(dá)到74.98%，IC50僅1.72mg/mL。

蛹蟲草，多糖，提取，響應(yīng)面，抗腫瘤活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草N102 由蛹蟲草CICC 14013經(jīng)亞硝基胍誘變得到，由本實(shí)驗(yàn)室保存；人宮頸癌細(xì)胞Hela 本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)液 長春博德生物有限公司；MTT、DMSO 生工生物工程（上海）公司；胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BAS） 寶泰克生物科技公司；蒽酮、正丁醇、三氯甲烷、無水乙醇、濃硫酸 均為分析純。

FA1004型電子天平 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-66恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；TDL-4B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；752紫外可見分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；77530-30LAB冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；FW 100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；MC0-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；IX71倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS公司；550型酶聯(lián)檢測儀 美國Bio-2Rad公司；可調(diào)式微量取液器 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 采用液體深層發(fā)酵的方法獲得蛹蟲草N102的菌絲體[14]，發(fā)酵液4800r/m in，離心15m in，棄去上清液，加去離子水洗滌菌絲體2次。菌絲體真空冷凍干燥，用小型機(jī)械粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，即得蛹蟲草N102菌絲體干粉。

1.2.2 蛹蟲草N102多糖的提取 取菌絲體干粉100g，加入95%乙醇，于30℃振搖過夜，真空抽率回收菌粉，重復(fù)一次，風(fēng)干后，加入一定量的去離子水，于恒溫水浴中提取。8000r/m in離心10m in，收集上清液，55℃減壓濃縮至1L，離心，收集上清液，于-20℃冷凍24h，室溫緩慢融化，4℃，10000r/min離心除去沉淀。反復(fù)數(shù)次直到無沉淀為止。上清液中加入10mg胰蛋白酶，于37℃水解6h。上清液中加入1/4體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）充分混勻，靜止分層后，12000r/m in離心5min，合并上清液，反復(fù)數(shù)次至無蛋白層為止。上清液于1×104u的透析袋中去離子水透析48h，收集透析內(nèi)液，55℃減壓濃縮至500m L，分別用2、4、6倍體積的95%乙醇于4℃進(jìn)行分級沉淀，沉淀冷凍干燥后，稱重，即得到蛹蟲草N102的2、4、6倍醇沉多糖。

1.2.3 蛹蟲草N102多糖提取工藝條件的優(yōu)化 為了確定蛹蟲草N102多糖的最佳水提工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)對影響多糖提取率的提取溫度、提取時間和水料比三個主要因素進(jìn)行優(yōu)化。并在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，考察提取溫度、提取時間、水料比三個自變量對響應(yīng)值（多糖提取率）的影響，并得到蛹蟲草N102多糖的最佳提取工藝條件。響應(yīng)面分析的因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

送謝氏父子走的時候，蘇楠說，剛才沒告知你們，咱們的談話我已經(jīng)錄了音。我想提醒你們的是，現(xiàn)在我的委托人的女兒連工作都丟了，失業(yè)在家，生活很不容易。你們剛才也承認(rèn)了，當(dāng)年是我的委托人救了謝老先生。現(xiàn)在她有難了，你們不應(yīng)該伸手施救嗎？你們竟然借此機(jī)會要挾她，索取什么五千塊錢誤工補(bǔ)助，我覺得這不是一個有良知的人做的事。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.4 MTT比色法測定蛹蟲草N102多糖抗腫瘤活性收集對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后，加DMEM培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，并接種于96孔板中，每孔100μL，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×104個每孔后，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞在孔內(nèi)鋪滿。換無血清DMEM培養(yǎng)基，孵育24h后，棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入150μL樣品濃度分別為0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12mg/m L的無血清培養(yǎng)基，對照組則加入等體積的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48、72h。每孔加入20μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10m in，再用酶標(biāo)儀測定OD570，計(jì)算抑制率。

1.2.5 分析方法 樣品中多糖含量采用蒽酮硫酸法進(jìn)行測定[15]，還原糖含量采用DNS法進(jìn)行測定[16]，蛋白質(zhì)含量采用Brad ford法進(jìn)行測定[17]。

多糖提取率（w/w，%）=[提取液中多糖含量（g）/原料重量（g）]×l00

多糖得率（w/w，%）=[醇沉粗多糖質(zhì)量（g）/原料重量（g）]×l00

2 結(jié)果與討論

2.1 蛹蟲草N102多糖提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 提取溫度對多糖提取率的影響 以30∶1（m L∶g）水料比，分別將蛹蟲草N102菌粉懸液于40、50、60、70、80、90℃恒溫水浴中浸提4h，8000r/m in離心10m in，分離上清液并測定多糖提取率，結(jié)果如圖1所示，多糖提取率隨著提取溫度的增加而增大，當(dāng)提取溫度達(dá)到80℃時提取率達(dá)到最大值，大于80℃時多糖提取率反而呈下降趨勢。

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effectof extraction temp on the yield of polysaccharide

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響 以30∶1（m L∶g）水料比，將蛹蟲草N102菌粉懸液于80℃恒溫水浴中，分別浸提1、2、3、4、5h，8000r/m in離心10m in，分離上清液并測定多糖提取率。結(jié)果如圖2所示，隨提取時間的增長蛹蟲草N102多糖提取率逐漸增大，提取時間達(dá)到3h時蛹蟲草N102多糖提取率達(dá)到最大，其后多糖提取率則趨于平穩(wěn)。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effectof extraction time on the yield of polysaccharide

2.1.3 水料比對多糖提取率的影響 分別以20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（m L∶g）水料比，將蛹蟲草N102菌粉懸液于80℃恒溫水浴中，浸提3h，8000r/min離心10m in，分離上清液，測定蛹蟲草N102多糖提取率。結(jié)果如圖3所示，水料比未達(dá)到50∶1（m L∶g）時，蛹蟲草N102多糖提取率隨著水料比的增加而增大，水料比為50∶1（m L∶g）時蛹蟲草N102多糖提取率達(dá)到最大值，然后隨著水料比的增大蛹蟲草N102多糖的提取率趨于穩(wěn)定。

圖3 水料比對多糖提取率的影響Fig.3 Effectof solvent/solid ratio on the yield of polysaccharide

2.1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草N102多糖的提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以提取溫度、提取時間、水料比為自變量，菌絲體多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對三個因素進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的蛹蟲草N102多糖提取工藝。

根據(jù)表1設(shè)計(jì)因素水平，對提取溫度（X1）、提取時間（X2）和水料比（X3）分別進(jìn)行編碼如下：X1=（Z1-80）/10，X2=（Z2-3）/1，X3=（Z3-50）/10。表2顯示了響應(yīng)面分析方案及結(jié)果，采用SASRSREG對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值對三個自變量的多項(xiàng)二次回歸方程為：

采用F檢驗(yàn)對回歸方程中各自變量對響應(yīng)值（Y）的顯著性進(jìn)行判定，回歸結(jié)果如表3所示。方程中X1X2、X2X3為影響顯著項(xiàng)（p＜0.05），X1、X2、X3為影響極顯著項(xiàng)（p＜0.01），一次項(xiàng)（p=0.00105）和平方項(xiàng)（p=0.00022）均為極顯著項(xiàng)，而交互項(xiàng)（p=0.02655）為影響顯著項(xiàng)，這說明各自變量對響應(yīng)值的影響除了線性關(guān)系外，平方項(xiàng)和交互項(xiàng)對響應(yīng)值的影響也很大，而回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9840，說明該模型可較為準(zhǔn)確描述各自變量與響應(yīng)值之間的相互關(guān)系。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiments design and the results of experiments

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Statistical results of regression analysis

圖4為回歸模型的響應(yīng)面及等高線圖，可以清晰直觀的反映三個因素對蛹蟲草N102多糖提取率的影響。由圖4（A）可以看出，其等高線呈橢圓形，橢圓形的軸線與X1和X2坐標(biāo)軸間存在一個夾角，圖中等高線較為密集，且X1（提取溫度）處于不同水平時，X2（提取時間）對響應(yīng)值Y的影響變化規(guī)律不同；同樣，X2處于不同水平時，X1對Y值的影響也呈不同規(guī)律變化，表明提取溫度和提取時間的交互作用對蛹蟲草N102多糖的提取率影響顯著（p=0.02009）。由圖4（B）可以看出，X1（提取溫度）與X3（水料比）對Y值的影響規(guī)律隨另一因素的改變并不明顯，說明提取溫度與水料比的交互作用對蛹蟲草N102多糖提取率的影響不顯著（p=0.92924）。由圖4（C）可以看出，其等高線呈橢圓形，橢圓形的軸線與X2和X3坐標(biāo)軸間存在一定夾角，圖中等高線較為密集，且X2（提取時間）處于不同水平時，X3（水料比）對Y值的影響的變化規(guī)律不同；同樣，X3處于不同水平時，X2對響應(yīng)值的影響也呈不同規(guī)律變化，表明X2、X3的交互作用對蛹蟲草N102多糖的提取率影響顯著（p=0.02009）。對圖4的直觀分析結(jié)果與回歸分析結(jié)果一致。

采用SAS工具箱對回歸方程進(jìn)行一階求偏導(dǎo)，得到響應(yīng)值（Y）處于最大值時的X1、X2、X3的編碼值分別為：X1=0.3048，X2=0.1803，X3=0.1939，即蛹蟲草N102多糖提取的最佳提取工藝條件為：提取溫度為83℃，提取時間為3.2h，水料比為52∶1（m L∶g），在此條件下，預(yù)測多糖的提取率為7.16%。

圖4 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surfacegraphs and contour plots

2.1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在蛹蟲草N102多糖的最佳提取條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。得到的蛹蟲草N102多糖提取率分別為7.28%、7.19%、7.25%，平均值為7.24%，與理論預(yù)測值的相對誤差僅為1.16%，證實(shí)了該模型的預(yù)測性。由此得到蛹蟲草N102菌絲體多糖的最佳提取工藝為：提取溫度為83℃，提取時間為3.2h，水料比為52∶1（m L∶g）。

2.2 蛹蟲草N102多糖的制備

采用乙醇分級沉淀制備蛹蟲草N102菌絲體2倍醇沉（2FPS）、4倍醇沉（4FPS）和6倍醇沉（6FPS）多糖。乙醇沉淀法能去除多糖中的雜質(zhì)，并且根據(jù)乙醇的濃度，將不同分子量的物質(zhì)進(jìn)行分級。2FPS、4FPS和6FPS的得率、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量及總糖含量如表4所示，4FPS的純度最高且得率最大，其中多糖含量可達(dá)到73.43%，而蛋白質(zhì)含量僅為1.39%，且多糖得率為1.97%，分別是2FPS和6FPS得率的4.58倍和2.94倍。由此可見，4倍乙醇沉淀是分離蛹蟲草N102多糖的有效手段。

表4 2FPS、4FPS和6FPS的得率、蛋白質(zhì)及糖含量Table 4 The yield，protein and sugar contentof 2FPS 4FPS and 6FPS

2.3 蛹蟲草N102多糖抗腫瘤活性研究

2.3.1 2FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響 2FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的作用與給藥濃度的關(guān)系密切，如圖5所示。當(dāng)作用時間相同時，隨給藥濃度的增大2FPS對Hela細(xì)胞的體外抑制作用也顯著提高。當(dāng)作用時間為24h時，在給藥濃度范圍內(nèi)，2FPS對Hela細(xì)胞的抑制作用不超過15%。作用時間達(dá)到48h后，2FPS對Hela細(xì)胞的抑制作用大幅度提高。當(dāng)作用時間增大時，2FPS對Hela細(xì)胞的抑制作用也顯著提高，作用時間由24h增大到72h，5.12mg/m L的2FPS對Hela細(xì)胞的抑制作用由14.63%增大到50.25%。當(dāng)2FPS對Hela細(xì)胞作用72h時其IC50為4.70mg/m L。

圖5 2FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響Fig.5 Inhibition of proliferation of Hela cells by 2FPS

2.3.2 4FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響 4FPS對腫瘤細(xì)胞的抑制率隨作用時間明顯提高，如圖6所示。4FPS對Hela細(xì)胞的體外抑制作用具有明顯的時間依賴性。在作用時間較短時（24h），給藥濃度低于0.64mg/m L時，4FPS對Hela細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出促進(jìn)作用；給藥濃度高于0.64mg/m L時，4FPS逐漸對Hela細(xì)胞呈現(xiàn)出一定的抑制作用。當(dāng)作用時間達(dá)到48h時，4FPS對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增大，當(dāng)給藥濃度達(dá)到5.12mg/m L時，4FPS對Hela細(xì)胞的抑制作用可達(dá)到57.11%。在作用時間為72h時，隨著給藥濃度的增加，4FPS對Hela細(xì)胞的體外增殖的抑制作用大幅度提高，抑制率由11.79%增大到74.98%。當(dāng)4FPS對Hela細(xì)胞作用時間為48和72h時，其IC50分別為3.06和1.72mg/m L。

圖6 4FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響Fig.6 Inhibition of proliferation of Hela cells by 4FPS

2.3.3 6FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響 如圖7所示，6FPS對Hela細(xì)胞的體外增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用具有較強(qiáng)的濃度依賴關(guān)系，而作用時間對抑制作用也有一定的影響。當(dāng)給藥濃度低于1.28mg/m L時，6FPS對Hela細(xì)胞作用48h時對其抑制作用最強(qiáng)，其次分別為作用72h和24h時；當(dāng)給藥濃度高于1.28mg/m L時，隨作用時間的延長6FPS對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增大，但即使在最大給藥濃度時，6FPS對Hela細(xì)胞作用也低于40%。

圖7 6FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響Fig.7 Inhibition of proliferation of Hela cells by 6FPS

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)預(yù)測蛹蟲草N102多糖的最佳提取工藝為：提取溫度83℃，提取時間3.2h，水料比52∶1（m L·g-1），此時預(yù)測多糖提取率為7.16%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中蛹蟲草N102多糖提取率的平均值為7.24%，與理論預(yù)測值的相對誤差為1.16%，可見該模型能較好地預(yù)測蛹蟲草N102菌絲體多糖的提取率。采用乙醇分級沉淀的方法分離得到三種多糖組分，MTT法研究結(jié)果表明，2FPS、4FPS和6FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的影響與作用時間和給藥濃度具有顯著的量效關(guān)系。其中4FPS對Hela細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)作用時間為72h時，4FPS對Hela細(xì)胞體外增殖的IC50僅1.72mg/m L。通過分析證實(shí)4FPS的多糖含量最高，可見蛹蟲草N102多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

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Study on the optim ization of the extraction conditions and the anticancer activity of polysaccharide from the highly-yielding strain Cordyceps Militaris N102

LU Cheng-yu1，ZHANG Zun-kai1，LIU Yan1，ZHANG Xiao-lei3，ZHANG Yi-jun1，TENG Li-rong1，2，*
（1.College of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China；2.ZhuhaiCollege，Jilin University，Zhuhai519041，China；3.Faculty of Science，National University of Singapore，Kent Ridge 118426，Singapore）

The polysaccharide in highly-yield ingmutagenic strain Cordycepsm ilitaris N102 was studied.Response surface methodology（RSM）was app lied to op tim ize the extrac tion conditions of polysaccharide in Cordyceps m ilitaris N102 m ycelium.After repeated freeze-thaw，dep roteinization，dialysis and ethanol p recip itation，crude polysaccharide of Cordycepsm ilitaris N102（2FPS，4FPS and 6FPS）was ob tained.The MTT assay was app lied to study the inhibitory activity of crude polysaccharide of Cordycepsm ilitaris N102 on the Hela cells p roliferation. The results indicated that the op timum p rocess cond itions for the extraction cond itions of adenosine were as follow：extracting tem perature was 83℃，extracting time was 3.2h and solvent/solid ratio was 52∶1（m L∶g）.The average yield of adenosine in 3 validation experiments was 7.24%.The relative error was 1.16%.The results of MTT assay showed that polysaccharides p resented inhibitory activity on the cells p roliferation of Hela.After 72h incubation，the inhibition rate of Hela was 74.98%，and the IC50was only 1.72mg/m L.

Cordycepsm ilitaris；polysaccharide；extrac tion；response surface methodology；anticancer activity

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）14-250-05

2012－03－06 *通訊聯(lián)系人

逯城宇（1990－），男，學(xué)士，主要從事生物技術(shù)制藥方面的研究。