任瓊瓊，陳麗清，韓佳冬，張宇昊，2，*，馬 良，2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)的提取研究

任瓊瓊1，陳麗清1，韓佳冬1，張宇昊1，2，*，馬 良1，2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

實(shí)驗(yàn)采用堿提酸沉法與超濾相結(jié)合從馬鈴薯淀粉廢水中提取蛋白質(zhì)。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化堿提酸沉工藝，結(jié)果表明，堿提酸沉法提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為：堿提pH9.35，堿提時(shí)間59min，酸沉pH3.41，酸沉?xí)r間10min。在此條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)54.24%。酸沉液采用10ku超濾膜進(jìn)一步提取蛋白，最終總提取率可達(dá)93.42%。

馬鈴薯淀粉廢水，堿提酸沉，超濾，蛋白質(zhì)

馬鈴薯蛋白是良好的蛋白質(zhì)來源，將馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質(zhì)提取再利用不僅可以改善環(huán)境，而且能夠回收一定的粗蛋白，提高馬鈴薯淀粉生產(chǎn)的附加值。目前有報(bào)道稱可采用磁性殼聚糖微球吸附以及臭氧鼓泡等新型的方法回收馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質(zhì)。所謂磁性殼聚糖是指內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物（鐵、鈷、鎳及其氧化物）的超細(xì)粉末且具有磁響應(yīng)性的殼聚糖微球，其中含有重金屬物質(zhì)，因此回收蛋白質(zhì)的安全性等需進(jìn)一步驗(yàn)證。傳統(tǒng)提取蛋白質(zhì)的方法主要有：加熱法、加酸法、絮凝沉淀法以及超濾法。加熱提取蛋白的提取率達(dá)到了75%左右，但是加熱使蛋白產(chǎn)生不可逆沉淀，對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)影響很大；加酸提取蛋白的得率可達(dá)40%；絮凝法對(duì)廢水的COD去除率較高，但是對(duì)蛋白質(zhì)的回收率卻很低。目前，國(guó)內(nèi)采用膜技術(shù)回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)的研究很少，僅有少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室研究報(bào)道[1]。廢液直接用于超濾不僅對(duì)膜造成很大的壓力，影響膜的壽命；而且經(jīng)濟(jì)效益較低。本研究首先采用堿提酸沉提取廢液蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上結(jié)合超濾進(jìn)一步提取蛋白，以期在有效減輕直接超濾對(duì)膜造成損耗的前提下，充分提取廢液中的蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

考馬斯亮藍(lán) 成都科龍化工試劑廠；氫氧化鈉，鹽酸，亞硫酸氫鈉。

752紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；QL-901漩漩渦震蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì) 雷磁分析儀器廠；JA 2003A、JA50002電子分析天平 上海精天；101型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 余姚金惠電子設(shè)備廠；CMSC300超濾杯 上海摩速科學(xué)器材有限公司；entrifuge 5810型高速離心機(jī)，JYL-C022型九陽料理機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉廢水的制備 將馬鈴薯切碎后用打漿機(jī)絞碎，加水（1∶4）、1%亞硫酸氫鈉攪拌10min，再靜置15m in，用雙層濾布過濾，濾液靜置2h后，在6000r/m in轉(zhuǎn)速下離心10m in，取上清液作為實(shí)驗(yàn)水樣。在攪拌過程中加入亞硫酸氫鈉的目的是防止水樣褐變[2]。

1.2.2 堿提酸沉法提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白 淀粉廢水→堿液提取→6000r/min離心→調(diào)酸沉淀→8000r/min離心取上清液→堿液提取→6000r/min離心→調(diào)酸沉淀→8000r/min離心→蛋白質(zhì)沉淀→冷凍干燥→粗蛋白粉

1.2.3 堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)評(píng)價(jià)堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的效果，單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件定為：堿提pH為8.0，提取時(shí)間為60min，酸沉pH為4.5，酸沉?xí)r間為10m in。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分析堿提pH、堿提時(shí)間、酸沉pH、酸沉?xí)r間對(duì)蛋白提取率的影響。各因素梯度分別為：堿提pH：7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10；堿提時(shí)間：1、5、30、60、120m in；酸沉pH：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酸沉?xí)r間：5、10、20、30、40m in。每個(gè)因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。對(duì)上清液進(jìn)行二次堿提酸沉后，測(cè)上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取了三個(gè)主要影響因子：堿提pH、堿提時(shí)間、酸沉pH。再按中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)三因素三水平共23組實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼如表1所示。

表1 三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels for the experiment

1.2.5 酸沉上清液中蛋白超濾提取 使用10ku聚砜膜在壓強(qiáng)0.12~0.15MPa、溫度25℃的條件下對(duì)酸沉上清液進(jìn)行超濾，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定超濾濃縮液的蛋白質(zhì)含量，并以蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 溶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[3]。在595nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以牛血清白蛋白濃度1g/L為標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定各樣品。蛋白提取率按以下公式計(jì)算。

蛋白提取率（%）=（提取后上清液蛋白含量/原液蛋白含量）×100

2 結(jié)果與討論

2.1 堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 堿提pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖1得知，在pH7~9.5范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的提取率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，pH 9.5時(shí)達(dá)到51.95%±0.029%，隨著pH進(jìn)一步上升，提取率的增加不顯著。堿性條件可增溶蛋白的原因主要在于增加了蛋白負(fù)電荷的攜帶量，使維系蛋白在溶液體系的平衡力加強(qiáng)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)pH在7~9.5范圍內(nèi)時(shí)，蛋白負(fù)電荷攜帶量隨著pH的增加而增加，蛋白溶解性增加。pH大于9.5時(shí)，隨著pH的進(jìn)一步增加，蛋白的電荷攜帶量因趨于飽和而不再明顯增加，蛋白得率也就不再明顯提高。此外，強(qiáng)堿條件下蛋白液的粘度增加，不僅不利于后續(xù)的離心分離，而且會(huì)造成蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的降低[4]。綜合考慮以上因素，初步選取較適堿提pH為9.5。

圖1 堿提pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effectof alkaliextraction pH on the extraction yield of protein

2.1.2 堿提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，隨著堿提時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取率先上升后下降，在60m in時(shí)提取率最大，達(dá)到51.10%±0.052%。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的溶出率提高，蛋白質(zhì)的提取率增大。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60m in時(shí)，蛋白質(zhì)的溶出達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到了峰值，而隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，廢水中的殘余淀粉可能與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)難以溶出，提取率降低。因此，初步選取最適提取時(shí)間為60m in。

圖2 堿提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effectof alkaliextraction time on the extraction yield of protein

圖3 酸沉pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effectof acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.1.3 酸沉pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，在酸沉pH 2.5~3.5范圍內(nèi)，蛋白提取率呈先上升后下降趨勢(shì)，且在pH 3.0時(shí)達(dá)到第一個(gè)峰值，提取率為50.76%±0.0040%，在pH3.5~5.5范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率同樣呈先上升后下降趨勢(shì)，且在pH 4.0時(shí)達(dá)到第二個(gè)峰值，提取率為50.95%±0.052%。等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其顆粒極易相互碰撞凝聚而沉淀析出，因此，此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)的溶解度最小。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，酸沉過程中出現(xiàn)了兩個(gè)等電點(diǎn)，出現(xiàn)此情況的可能原因是由于堿提取導(dǎo)致多種蛋白組分同時(shí)溶出，而不同蛋白質(zhì)有不同等電點(diǎn)[5]。綜合考慮各因素，初步選取較適酸沉pH為4.0左右。

2.1.4 酸沉?xí)r間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可以看出，蛋白質(zhì)的提取率與酸沉?xí)r間的曲線呈先上升后下降的趨勢(shì)，在沉淀時(shí)間為20m in時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到了48.26%±0.023%。蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，呈絮狀沉淀物，此現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用。結(jié)絮作用所生成的絮狀物不穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可再溶于溶液中。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在沉淀時(shí)間為20m in時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到了峰值，隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，結(jié)絮后的蛋白質(zhì)可能再溶于溶液而導(dǎo)致提取率降低。與其他影響因素相比，酸沉?xí)r間研究范圍內(nèi)蛋白提取率波動(dòng)較小，即酸沉?xí)r間對(duì)蛋白提取率的影響較小，因此在進(jìn)一步的工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，不再考慮酸沉?xí)r間的影響，綜合考慮后固定為10m in。

圖4 酸沉?xí)r間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of acid precipitation time on the extraction yield of protein

2.2 堿提酸沉法制備馬鈴薯廢水蛋白工藝條件的優(yōu)化和最佳因素水平的選擇

三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣與結(jié)果如表2所示，其中實(shí)驗(yàn)序號(hào)由Design-Expert7.1.3軟件隨機(jī)產(chǎn)生。

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert7.1.3軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到馬鈴薯淀粉廢水蛋白質(zhì)提取率對(duì)堿提pH（A）、堿提時(shí)間（B）、酸沉pH（C）的二元多項(xiàng)回歸模型為：

對(duì)此模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3，回歸方程系數(shù)顯著性結(jié)果見表4。

由表3的模型方差分析結(jié)果得知，模型的p值為0.0175，達(dá)到顯著性差異。失擬項(xiàng)的p值為0.0531，大于0.05不顯著，所以二次模型成立，因此可用此模型分析和預(yù)測(cè)堿提酸沉提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白工藝的優(yōu)化。

由表4回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果得知，模型的一次項(xiàng)A、B均不顯著，C顯著；二次項(xiàng)A、B顯著，C不顯著；交互項(xiàng)均不顯著；其中酸沉pH的影響因素最大。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design of RSM and its experimental values

表3 回歸模型分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance testof coefficient in regression equation

剔除不顯著項(xiàng)后的方程模型為：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2

2.2.2 馬鈴薯淀粉廢水蛋白質(zhì)堿提酸沉提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖見圖5~圖7。

圖5~圖7直觀的反映了各因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。堿提pH與堿提時(shí)間之間的交互作用、堿提pH和酸沉pH之間的交互作用、堿提時(shí)間和酸沉pH之間的交互作用均不顯著。且酸沉pH、堿提pH對(duì)馬鈴薯蛋白提取率的影響最為顯著；而堿提時(shí)間次之。

圖5 堿提pH與堿提時(shí)間交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響Fig.5 Combined effects of alkaliextraction pH and time on the extraction yield of protein

圖6 堿提pH與酸沉pH交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響Fig.6 Combined effects of alkaliextraction pH and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

圖7 堿提時(shí)間與酸沉pH交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響Fig.7 Combined effects of alkaliextraction time and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.2.3 提取條件的優(yōu)化[6-7]通過Design-Expert7.1.3軟件分析，得出堿提酸沉提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白的最優(yōu)工藝為堿提pH 9.35、堿提時(shí)間58.67m in、酸沉pH 3.41，酸沉?xí)r間10m in，該條件下蛋白質(zhì)提取率預(yù)測(cè)值為55.02%。根據(jù)上述最優(yōu)提取工藝，結(jié)合實(shí)際操作情況，將提取工藝參數(shù)修正為堿提pH 9.35、堿提時(shí)間59m in、酸沉pH 3.41，酸沉?xí)r間10m in，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的平均蛋白質(zhì)提取率為54.24%，與預(yù)測(cè)值相近，證實(shí)了該模型的合適性。

2.2.4 酸沉上清液中蛋白超濾提取 酸沉液進(jìn)一步超濾回收，蛋白質(zhì)回收率達(dá)到了85.62%。結(jié)合堿提酸沉工藝總提取率可達(dá)93.42%。

超濾的分離機(jī)理主要是物理篩分作用，而膜的化學(xué)性質(zhì)對(duì)分離特性影響不大[8]。超濾膜具有較高的多孔性，只能阻擋具有低滲透壓的大分子（如蛋白質(zhì)或膠體）通過。較小的溶質(zhì)分子與水一起被搬運(yùn)通過濾膜。因此超濾可在較低的壓力下進(jìn)行[9]。張澤俊等[10]的研究表明，使用切割分子量1.5萬的醋酸纖維素膜對(duì)馬鈴薯廢水進(jìn)行處理可截留85%的蛋白質(zhì)；呂建國(guó)等[11]研究表明，使用相對(duì)切割分子量2萬的PE膜對(duì)馬鈴薯廢水進(jìn)行處理可回收其中約90%的蛋白。但是由于馬鈴薯廢液中含有多種有機(jī)物，極易造成膜的嚴(yán)重?fù)p傷和堵塞，無法長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)高效生產(chǎn)。堿提酸沉與超濾相結(jié)合不僅總回收率高，而且采用堿提酸沉進(jìn)行預(yù)處理之后，可有效提取大部分馬鈴薯廢水蛋白，大大減輕膜的壓力，對(duì)于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有積極意義。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了馬鈴薯淀粉廢水蛋白質(zhì)提取較適條件為：堿提pH 9~10，堿提時(shí)間60m in，酸沉pH3~4.5，酸沉?xí)r間10min。

3.2 采用響應(yīng)面分析法對(duì)蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式回歸方程數(shù)學(xué)模型：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2。確定了馬鈴薯淀粉廢水預(yù)處理的最適工藝條件為：堿提pH 9.35，堿提時(shí)間59m in，酸沉pH 3.41，酸沉?xí)r間10m in。在此條件下，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)54.24%。

3.3 優(yōu)化后的堿提酸沉工藝結(jié)合超濾技術(shù)提取馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質(zhì)，總得率可達(dá)93.42%。

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Research of protein extracting from potato starch waster-water

REN Qiong-qiong1，CHEN Li-qing1，HAN Jia-dong1，ZHANG Yu-hao1，2，*，MA Liang1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing，Chongqing 400716，China）

The potato p rotein from starch p roducing waste-water was extrac ted by alkali-solution and acidisolation combined w ith ultra-filtration.The extraction p rocessing was op tim ized by sing le factors and response surface analysis.The results showed that the op timum conditions of extrac tion p rocessing of p rotein from potato starch waste-water by alkali-solution and acid-isolation were as follow：the alkali-solution pH9.35，alkali-solution time 59m in，acid-isolation pH3.41，acid-isolation time 10m in.Under these conditions，the extraction rate of p rotein reached 54.24%.While combined w ith ultra-filtration，the extrac tion rate of p rotein reached 93.42%.

potato starch wastewater；alkali-solution and acid-isolation；ultra-filtration；p rotein

TS235.2

B

1002-0306（2012）14-0284-04

2011－11－15 *通訊聯(lián)系人

任瓊瓊（1986-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

石柱農(nóng)業(yè)科技綜合示范基地科技專項(xiàng)基金。