黃驥，宋治遠(yuǎn)，張倩

心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)主要依靠縫隙連接(gap junction，GJ)來完成。竇房結(jié)作為心臟的起搏活動(dòng)中心，其GJ主要起到維持規(guī)律的激動(dòng)頻率以及傳導(dǎo)激動(dòng)到心房的作用［1］，目前，構(gòu)成 GJ的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)在原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中如何表達(dá)尚不完全清楚［2-3］。本研究旨在探討原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞及心房肌細(xì)胞中不同Cx的表達(dá)及其差異，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠，雌雄不拘，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2儀器和試劑激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)、羊抗人Connexin43多克隆抗體、羊抗人Connexin45多克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗鼠Connexin40多克隆抗體(ADI公司)、SABC-FITC試劑盒和SABC-Cy3試劑盒(武漢博士德公司)、4%多聚甲醛液(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.3乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞原代培養(yǎng)按本實(shí)驗(yàn)室建立的原代乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行［4-5］。

1.4實(shí)驗(yàn)分組取培養(yǎng)48 h的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行Cx45、Cx43及 Cx40檢測(cè)，隨機(jī)分為 Cx45組、Cx43組、Cx40組。另取培養(yǎng)48 h乳鼠心房肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，作為對(duì)照組，隨機(jī)分為Cx45組、Cx43組、Cx40組。1.5免疫細(xì)胞化學(xué)處理①每孔細(xì)胞用4%多聚甲醛2 ml在室溫下固定30 min，吸出固定液，用PBS液清洗5 min×3次。②每孔中滴加1:20的PBS液稀釋的正常兔血清封閉液1 ml，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。③滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過夜。PBS液洗10 min×3次(不同的一抗實(shí)驗(yàn)選擇相同的一抗?jié)舛?，分別是Cx45為1:300、Cx43為1:300和Cx40為1:300)。④滴加二抗(1:100)，37℃30 min，PBS液洗10 min×3次。⑤滴加試劑 SABCFITC 或 SABC-Cy3(1:100 PBS)，37℃ 孵育 30 min，PBS液洗10 min×3次。⑥30%緩沖甘油封片;以上操作均避光進(jìn)行。隨機(jī)取細(xì)胞爬片中央?yún)^(qū)20個(gè)梭形細(xì)胞作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)時(shí)Cx45用FITC熒光標(biāo)記，Cx43用Cy3標(biāo)記，Cx40用FITC標(biāo)記。

1.6激光共聚焦檢測(cè)用激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS，NT)對(duì)經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法處理的原代培養(yǎng)乳鼠細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。FITC在490～495 nm激化，在520～530 nm發(fā)射黃祿色，呈熒光。Cy3在554 nm激化，在568～574 nm發(fā)射鮮紅色，呈現(xiàn)熒光。用于圖像采集的顯微鏡物鏡為40×油鏡，數(shù)值孔徑為1.3，主要參數(shù)如下:小孔孔徑225 μm，X軸掃描點(diǎn)數(shù)400，Y 軸掃描點(diǎn)數(shù)400，掃描步徑0.6 μm，掃描強(qiáng)度55%，激光強(qiáng)度300 mW。

多通道掃描記錄每個(gè)圖像(512×512像素)。每個(gè)細(xì)胞用相同的一抗和二抗?jié)舛?，并用同樣的掃描參?shù)掃描。每個(gè)細(xì)胞分層掃描(20層)及熒光信號(hào)疊加形成圖像，熒光定量數(shù)據(jù)由激光共聚焦顯微鏡自帶Quantify software采集分析所得。Cx熒光強(qiáng)度陽性定義為在0～255灰階強(qiáng)度中超過其閾值50［6］，Cx 定量如［7，9］文獻(xiàn)所述，將數(shù)字化圖像儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行圖像分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以(s)表示，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Cx的分布用激光共聚焦顯微鏡對(duì)經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法處理的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cx45免疫信號(hào)主要分布在胞膜上，表現(xiàn)為大小不一、不連續(xù)的熒光團(tuán)、斑片狀或散在的熒光點(diǎn)，在胞漿中有微量的分布(圖1);Cx43免疫信號(hào)也主要分布在胞膜上，呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點(diǎn)或斑片狀，細(xì)胞漿中僅微量的信號(hào)表達(dá)(圖2);Cx40免疫信號(hào)分布少，為大小不一、不連續(xù)的熒光點(diǎn)散在于胞膜上，而胞漿中幾乎沒有分布(圖3)。

2.2原代培養(yǎng)乳鼠心房肌細(xì)胞Cx的分布用激光共聚焦顯微鏡對(duì)經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法處理的乳鼠心房肌細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心房肌細(xì)胞以Cx40分布最為明顯，主要在胞膜上，呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點(diǎn)或斑片狀分布，胞漿中僅有微量的信號(hào)分布(圖4);心房肌細(xì)胞Cx45及Cx43的分布稀少，在胞膜上呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點(diǎn)或熒光斑片(圖5、6)。2.3免疫熒光定量分析免疫熒光定量分析顯示，乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Cx45免疫信號(hào)比心房肌細(xì)胞中高7.8倍(P＜0.01)，而Cx40的免疫信號(hào)則較心房肌細(xì)胞低4.0倍(P＜0.01)(表1)。

3 討論

圖1 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Cx45的表達(dá) 圖2 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Cx43的表達(dá) 圖3 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Cx40的表達(dá)

圖4 乳鼠心房肌細(xì)胞Cx40的表達(dá) 圖5 乳鼠心房肌細(xì)胞Cx43的表達(dá) 圖6 乳鼠心房肌細(xì)胞Cx45的表達(dá)

表1 原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞Cx表達(dá)的比較(s，n=10)

表1 原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞Cx表達(dá)的比較(s，n=10)

注:與心房肌細(xì)胞比較，aP＜0.01

Cx45 Cx43 Cx40竇房結(jié)細(xì)胞 86.46±5.76a 40.38±2.76 18.44±3.12組別a心房肌細(xì)胞10.28±2.13 26.34±4.86 65.25±7.86

縫隙連接(GJ)廣泛分布于各種動(dòng)物組織細(xì)胞之間，偶聯(lián)細(xì)胞間相互通訊，包括電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)。由縫隙連接蛋白(Cx)組成的GJ形成細(xì)胞間的通道，介導(dǎo)激動(dòng)從竇房結(jié)到達(dá)心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞各種Cx分布有區(qū)域性變化，這有助于正常心肌激動(dòng)傳導(dǎo)的各向異性和心房、心室規(guī)則的收縮和舒張。

研究發(fā)現(xiàn)竇房結(jié)中Cx的種類和量的多少與結(jié)內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的不均一性分布有關(guān)［10］。從竇房結(jié)的中心到周邊，細(xì)胞形態(tài)是逐漸改變的，其中出現(xiàn)了過渡細(xì)胞(既像P細(xì)胞又像心房肌細(xì)胞)。由竇房結(jié)中央到邊緣，上述三種Cx的種類和量的多少并不一致［11］。位于竇房結(jié)中心的P細(xì)胞被認(rèn)為是典型的起搏細(xì)胞，這種細(xì)胞不僅小并且“空”，由于竇房結(jié)結(jié)構(gòu)上的不均一性，大多數(shù)對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞的研究未區(qū)分竇房結(jié)中央?yún)^(qū)和外周區(qū)細(xì)胞，均推測(cè)研究的都是中央?yún)^(qū)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究經(jīng)過形態(tài)及電生理檢查證明我們培養(yǎng)的原代乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中的梭形細(xì)胞可能就是中央?yún)^(qū)P細(xì)胞［4-5］。

對(duì)多種動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，Cx45主要分布在竇房結(jié)和心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)［9，12］。本研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中Cx45的信號(hào)強(qiáng)度是心房肌細(xì)胞的7.8倍，這一結(jié)果支持在乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中主要表達(dá)Cx45的結(jié)論［2］。本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)對(duì)照組乳鼠心房肌細(xì)胞Cx45表達(dá)為陰性，與國(guó)內(nèi)的報(bào)道是一致的［12］。

多數(shù)研究認(rèn)為在竇房結(jié)中至少在中央?yún)^(qū)細(xì)胞中Cx43是不存在的［13］。但是本研究發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中有Cx43中量表達(dá)，與以前的文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果不同，其原因可能為:①動(dòng)物種屬的區(qū)別;②本研究用新生的乳鼠進(jìn)行研究，而大鼠Cx43在不同的發(fā)育階段其表達(dá)是有改變的(即增齡性改變)，而在新生鼠中表達(dá)可能較高［6，10］;③可能與使用的單克隆抗體或多克隆抗體有關(guān);④沒有免疫標(biāo)記并不意味著就不存在，這是因?yàn)楦]房結(jié)中GJ可能本來就小，如果小到超過免疫標(biāo)記的底線就不會(huì)有表達(dá);⑤從功能上講，Cx43與Cx45在竇房結(jié)細(xì)胞間形成異質(zhì)性通道，更有利于竇房結(jié)中央?yún)^(qū)向外周的電傳導(dǎo)［14］，故提示不同種動(dòng)物的不同組織由于功能不同，其Cx組成的GJ具有不同的組成。

文獻(xiàn)報(bào)道Cx43在乳鼠心房肌細(xì)胞表達(dá)較弱，與本研究結(jié)果相似［15-16］。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞中主要表達(dá)Cx40［17］，本研究也顯示對(duì)照組心房肌細(xì)胞Cx40表達(dá)豐富，是竇房結(jié)細(xì)胞的4倍，表明Cx40是乳鼠心房肌細(xì)胞主要的Cx。

近年來，用免疫電鏡、免疫熒光、電生理技術(shù)等均證實(shí)竇房結(jié)內(nèi)有 GJ和 Cx［1，6-7］，本研究結(jié)果也支持在竇房結(jié)組織中存在GJ的觀點(diǎn)，此可能與竇房結(jié)細(xì)胞中橋粒等閏盤力學(xué)結(jié)構(gòu)可能不發(fā)達(dá)，而電學(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)完善的特性有關(guān)。

當(dāng)細(xì)胞分離培養(yǎng)時(shí)，GJ不會(huì)分解而是保存其完整結(jié)構(gòu)，只是在膜上快速封閉而維持在膜上的位置。在兔心肌細(xì)胞中表面連接無胞吞作用，也無GJ泡［17］的移動(dòng)，且長(zhǎng)達(dá) 22 h 也無新的 GJ形成［18］。因此，可以想象在細(xì)胞分離培養(yǎng)時(shí)，GJ仍保持穩(wěn)定。本研究采用原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，不是急性分離的細(xì)胞，從分離、培養(yǎng)到固定的時(shí)間長(zhǎng)于急性分離實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，Cx和GJ的分布與培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)［19］，本研究采用培養(yǎng)48 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在大鼠的心室肌細(xì)胞中已證明能使Cx位于細(xì)胞膜上，且心肌細(xì)胞中Cx是一致地分布于閏盤。故根據(jù)在普通心肌細(xì)胞上的資料，推測(cè)在原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中GJ將接近原來的位置而得到保存。在激光共聚焦檢查時(shí)，熒光點(diǎn)的部位能夠反映GJ的原始分布和它們的Cx組成。但很明顯，細(xì)胞的分離過程可能會(huì)改變Cx的表達(dá)，單個(gè)細(xì)胞上GJ和Cx的數(shù)目可能要少于急性分離的細(xì)胞，更少于完整組織中擁有的GJ數(shù)目。

綜上，在原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞中研究了Cx45、Cx43和Cx40的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中以Cx45表達(dá)為主，而心房肌細(xì)胞主要是Cx40表達(dá)，為更進(jìn)一步了解竇房結(jié)的生理功能提供幫助。

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