王小青，劉 婷

（長治市郊區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，山西長治046011）

CYP4基因家族屬于P450基因超家族中的一個基因家族，P450超家族蛋白是一組膜上同工酶，主要功能是代謝一些外源的有毒物質(zhì)及代謝和合成一些與生理功能有關(guān)的分子，如脂肪酸、前列腺素（prostaglandin，PG）、膽汁酸、膽固醇類的激素等[1]，由于進化的壓力，P450表現(xiàn)出很明顯的多樣性[2]。目前，昆蟲中已鑒定出CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP18，CYP28 等 27 個家族，其中，除了CYP4家族外，全是昆蟲特異性家族[4]，這些基因家族都屬于P450基因超家族。在已測出全序列基因組的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中，P450 基因有 90 個，其中，超過1/2屬于CYP4和CYP6家族[5]。脊椎動物和無脊椎動物都含有CYP4基因，CYP4基因家族是P450超家族中最古老的基因家族之一，起源于1 000多萬a以前，早于脊椎動物和無脊椎動物分化[6]，其主要代謝昆蟲的內(nèi)源物質(zhì)（保幼激素、蛻皮激素、嗅覺有關(guān)的物質(zhì)[7]等），部分成員也可能在代謝外源物質(zhì)過程中起作用[8]，如黑腹果蠅的 CYP4E2[9]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的CYP4G8等。

目前，研究昆蟲P450的進化，CYP4是最好的材料。CYP4不是昆蟲所特有的基因家族，它具有較高的多樣性，可以通過其他動物的CYP4來確定進化的時間軸，有利于對分子進化機制的研究。植食性昆蟲對寄主的專一性是同它降解植物毒素的能力密切聯(lián)系的[10]。CYP4基因家族在昆蟲與植物的相互作用中起著非常重要的作用，果蠅中的CYP4D10基因決定著其對一種仙人掌的寄主專一性[11]。所以，研究CYP4家族的進化不僅僅能夠解釋一定的進化機制，還能進一步明確昆蟲與植物之間的關(guān)系，尤其是互利共生體系。

1 昆蟲CYP4家族的多樣性

長期的進化使得多樣性在生物界廣泛存在，如：物種的多樣性、生物大分子的多樣性、基因的多樣性等。作為細胞色素P450超家族中的一員，CYP4家族隨著進化也表現(xiàn)出了各種多樣性。

1.1 昆蟲CYP4家族擁有眾多的亞家族及其成員和基因變異體

由表1可知，CYP4家族成員是非常龐大的，其中包含許多假基因。假基因是和功能基因在序列上極為相似，但是又不能產(chǎn)生具有功能的產(chǎn)物的基因。在果蠅的90個P450基因中，有7個假基因[5]，在德國小蠊（Blattella germanica）中發(fā)現(xiàn)3個 CYP4C21假基因（CYP4C21P1，CYP4C21P2和CYP4C21P3）。還發(fā)現(xiàn)了P450的一些鑲嵌基因，即所謂的這段序列既有P450的特征序列，又含有與P450毫不相干的序列。這些鑲嵌序列的發(fā)現(xiàn)證明了內(nèi)部DNA的交換確實存在[6]。

表1 CYP4家族成員

1.2 同一種昆蟲不同生活史期各種CYP4基因表達不同

如火蟻中的CYP4AB1，CYP4AB2在成蟲中的表達量明顯多于蛹和幼蟲[12]，德國小蠊（Blattella germanica）中CYP4C21的nothern雜交結(jié)果表明，其在卵中的表達是十分微弱的，而在其他齡期蟲體中具有相似的表達[13]（圖1）。

在搖蚊中，CYP4G33基因在蛹和成蟲期的表達量較少，但是在各個蟲期均有表達[14]（圖2）。

1.3 不同種屬的昆蟲CYP4亞家族成員不同

目前，對昆蟲CYP4的研究主要集中在果蠅（Drosophila melanodaster）、按蚊（Anopheles gamibiae）、意大利蜜蜂（Apismellifera）等方面。已知從果蠅中鑒定的細胞色素P450CYP4家族的基因有：CYP4AC3，CYP4AA1，CYP4AC1，CYP4AC2，CYP4AD1，CYP4AE1，CYP4C3，CYP4D1，CYP4D2，CYP4D8，CYP4D14，CYP4D20，CYP4D21，CYP4E1，CYP4E2，CYP4E3，CYP4G1，CYP4G15，CYP4P1，CYP4P2，CYP4P3，CYP4S3；意大利蜜蜂中分離鑒定出 CYP4AA1，CYP4AV1，CYP4AZ1，CYP4G11[4]。在果蠅和蜜蜂中均有CYP4AA1基因，說明不同昆蟲可以含有相同的CYP4家族成員，這與CYP6家族基因不同[15]。但有些CYP4家族僅存在于一種昆蟲中，CYP4E僅存在于果蠅中，CYP4H僅在蚊子中發(fā)現(xiàn)[16]。

2 昆蟲CYP4家族的進化

2.1 CYP4家族的自然進化史

20世紀(jì)80年代以來，古生物學(xué)和地質(zhì)學(xué)的證據(jù)表明，地球上有細胞結(jié)構(gòu)的生命至少在地質(zhì)時代的太古宙早期即距今約35億a前就已存在[17]，而細胞色素P450作為呼吸鏈的主要成分，應(yīng)該與此時間相一致。Feyereisen[16]提出，細胞色素P450早于大氣中氧的積累。

昆蟲中CYP4家族比其他昆蟲細胞色素P450家族更接近于哺乳動物的CYP家族，因此，有可能CYP4家族是在哺乳動物與昆蟲分化前通過基因復(fù)制產(chǎn)生的。

2.2 昆蟲CYP4的進化機制

2.2.1 分子驅(qū)動假說 分子驅(qū)動用來解釋新的CYP4形成。分子驅(qū)動是通過內(nèi)部DNA的變動來改變種群的基因型的過程，這個過程是不受自然選擇影響的。這種內(nèi)部DNA的轉(zhuǎn)換機制多種多樣，包括基因復(fù)制、不等交換、基因的轉(zhuǎn)換和顛換、滑動復(fù)制和RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移等[13]。在昆蟲中有許多基因簇，通常我們認(rèn)為這些基因簇是同一個祖先基因經(jīng)過基因復(fù)制和基因轉(zhuǎn)化而來的[9]。

2.2.2 自然選擇 CYP4基因超家族是植食性昆蟲降解植物次生代謝物質(zhì)主要的酶，所以，有一種假設(shè)認(rèn)為，來自于植物次生代謝物質(zhì)的選擇壓力是導(dǎo)致CYP4多樣性的一個重要因子。但是現(xiàn)在有能證明這一假設(shè)的直接證據(jù)極少。研究寡食性及專食性昆蟲可以為這一假設(shè)提供一定的數(shù)據(jù)[18]。Michael等[18]以2種鳳蝶中CYP6B1的進化支持了以上假設(shè)。

2.2.3 動植物的協(xié)同進化 在昆蟲與植物的共生關(guān)系中，一方面，植物利用次生代謝物質(zhì)抵御其他植食性昆蟲的侵入；另一方面，昆蟲利用P450降解寄主植物產(chǎn)生的有毒次生代謝物質(zhì)[19-20]，正是在這種相互競爭的協(xié)同進化過程中，P450不斷地向前進化。

3 研究昆蟲CYP4家族進化的方法

對不同的P450分子間相互作用的早期研究是根據(jù)酶的催化活性、誘導(dǎo)性、免疫交叉反應(yīng)、亞細胞定位等進行的，雖然這為闡明不同P450間的關(guān)系提供了重要的信息，但是在這方面的研究中，蛋白質(zhì)和DNA的一級結(jié)構(gòu)將包含更多的信息。隨著CYP4家族研究的不斷深入，一些重要的進化研究方法逐漸被應(yīng)用于CYP4家族基因的研究。

3.1 基因不同部分的研究

3.1.1 外顯子 外顯子直接翻譯成蛋白質(zhì)，而最初研究P450基本上都是研究蛋白序列的，只是外顯子反映的信息應(yīng)該叫蛋白序列更準(zhǔn)確，因為1個氨基酸對應(yīng)3個密碼子，而且多個三聯(lián)體對應(yīng)1個氨基酸[21]。

3.1.2 內(nèi)含子 內(nèi)含子曾經(jīng)一度被視為“垃圾”，但是現(xiàn)在越來越受到進化學(xué)家的青睞，因為內(nèi)含子不像外顯子那樣具有功能，受外界的選擇壓力和功能的限制要小得多，所以，內(nèi)含子的進化基本上反映了DNA本身的進化，在進化的研究上更有意義[22]。P450的進化歷史實際上就是內(nèi)含子的獲得和失去的歷史[9]。

但是CYP4家族基因的內(nèi)含子的進化研究的較淺，僅僅局限在長度和位置上的差異[23]。

3.1.3 啟動子等其他功能片斷 外顯子和內(nèi)含子的研究往往要求擴增出足夠長的基因片段，但是由于試驗技術(shù)或者試驗材料的限制，經(jīng)常只能拿到很小的一部分序列，這就要求將得到的序列進行充分有效地分析。Hung等[24]對CYP6B亞家族基因的啟動子序列進行了研究，發(fā)現(xiàn)對1個物種中的CYP6B亞家族成員之間的比較可以為研究鳳蝶中各個基因的進化的機制提供信息。所以，當(dāng)只是拿到了目的基因的一部分時，可以考慮研究它的啟動子、兩端側(cè)翼區(qū)等特殊的區(qū)域。

3.2 蛋白序列的研究

蛋白序列的研究與外顯子的研究有一定的相似性，但是蛋白是最直接反映功能的生物大分子，可以運用生物信息學(xué)的方法來預(yù)測蛋白的高級結(jié)構(gòu)[25]，從而將蛋白和功能聯(lián)系起來[26]。而功能又往往與環(huán)境有關(guān)，我們就可以間接地把蛋白與環(huán)境聯(lián)系起來。地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）中的CYP4Y1的表達量就與外界的污染程度有關(guān)[27]。Li等[28]通過研究多食性和寡食性昆蟲反抵御（counterdefense enzymes），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP6B8要比CYP6B1具有更靈活的空間折疊，更具有彈性的催化口袋和更多的底物識別渠道。

4 結(jié)語

目前，對CYP4家族基因的研究主要集中在進化上[23]，且大多比較簡單，如內(nèi)含子的進化主要局限在位置和長度差異的研究上。Nelson[29]認(rèn)為，研究進化時，僅僅比較序列來形成分支是不夠的，有必要去研究其他的特征：內(nèi)含子-外顯子的界限，空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部或者之間的插入和缺失、一些基因簇特定的結(jié)構(gòu)。整個P450超家族基因都編碼著功能蛋白，所以，通過一些蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件對結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，建立結(jié)構(gòu)進化樹，也是將來CYP4家族基因研究的方向。再就是加強研究假基因、鑲嵌基因、基因簇等，這些在整個細胞色素P450中是較多的。

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