程宇坤，白建榮，張效梅，任 元，王秀紅

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，山西太原030031）

糯玉米又叫黏玉米、蠟質(zhì)玉米，其主要特點(diǎn)是籽粒中的淀粉全為支鏈淀粉。糯玉米具有許多優(yōu)良特性，品質(zhì)極佳。隨著人們生活水平的不斷提高，糯玉米作為鮮食玉米越來(lái)越受到人們的喜愛，并且其市場(chǎng)需求也越來(lái)越大。因此，糯玉米將是發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的良好資源。許多研究結(jié)果表明，糯玉米僅分布于亞洲東部，我國(guó)是糯玉米種質(zhì)的起源地，且擁有非常豐富的糯玉米種質(zhì)資源[1]，但我國(guó)糯玉米育種工作起步較晚。目前，糯玉米自交系多是將農(nóng)家糯玉米品種通過雜交、回交等方法導(dǎo)入到普通玉米骨干系中，或者直接利用糯玉米雜交種選育而成，多數(shù)自交系無(wú)系譜可查，自交系間的親緣關(guān)系也并不清楚。最初的遺傳多樣性研究采用形態(tài)標(biāo)記、系譜分析、配合力表型及同工酶等方法，但這些方法在進(jìn)行遺傳變異分析時(shí)均存在不同程度的局限性，因此，嚴(yán)重限制了我國(guó)糯玉米育種工作的進(jìn)一步突破。

近年來(lái)，SSR標(biāo)記技術(shù)已被證明是分析種質(zhì)資源多樣性并對(duì)其進(jìn)行類群劃分的有效手段，并在玉米種質(zhì)資源研究中得到廣泛利用和認(rèn)可。借鑒對(duì)普通玉米自交系的研究方法，利用SSR標(biāo)記技術(shù)研究糯玉米種質(zhì)資源將有利于進(jìn)一步在分子水平上確定糯玉米種質(zhì)資源的利用價(jià)值。前人已經(jīng)通過SSR標(biāo)記對(duì)糯玉米遺傳多樣性和雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分進(jìn)行了研究。王鵬文等[2-3]利用SSR標(biāo)記分別分析了30，40個(gè)糯玉米自交系的遺傳多樣性。陳坤等[4]利用48份糯玉米自交系遺傳多樣性的SSR標(biāo)記將糯玉米劃分為6類群，同時(shí)借助普通玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)劃分的研究方法，利用SSR標(biāo)記和適合的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，可以有效地將不同來(lái)源的糯玉米自交系劃分到相應(yīng)的種質(zhì)類群中，對(duì)指導(dǎo)糯玉米育種有重要參考價(jià)值。研究表明，SSR標(biāo)記應(yīng)用于糯玉米遺傳多樣性分析和雜種優(yōu)勢(shì)類群劃分的研究是可行的。

山西省地形復(fù)雜，形成了許多生態(tài)小氣候。山西省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所經(jīng)過多年培育，育成大量適合山西省當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)的糯玉米自交系，到目前為止，還未從分子水平上對(duì)其進(jìn)行遺傳闡釋，即揭示其遺傳多樣性、對(duì)其進(jìn)行分類，并研究這些糯玉米自交系與我國(guó)現(xiàn)有的幾大玉米種質(zhì)間的關(guān)系。本研究通過SSR標(biāo)記技術(shù)分析山西省糯玉米自交系的遺傳多樣性，并進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類群的劃分，旨在為提高雜交組配的科學(xué)性、提高育種效率和育種水平，為糯玉米種質(zhì)改良利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料分為2大部分：（1）6份標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，包括黃早 4，Mo17，丹 340，B73，掖 478 和齊319，分別代表唐四平頭群、蘭卡斯特群（Lancaster）、旅大紅骨群、Reid 群、PA群、PB群；（2）52 份山西省常引用和自選的糯玉米自交系。

1.2 糯玉米DNA的提取

采用CTAB法提取葉片基因組DNA，每份材料提取10株。用蛋白核酸定量測(cè)定儀測(cè)量DNA的濃度和質(zhì)量，并將DNA樣品質(zhì)量濃度稀釋至20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物選擇

采用建立國(guó)家玉米品種指紋庫(kù)的20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物（引物1～20）作為基本核心引物[5]，按照擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、在染色體上均勻分布的原則篩選出來(lái)的20對(duì)引物（引物21～40）為輔助核心引物[6-10]，另外選取其他較好的引物9對(duì)（引物41～48）。

1.4 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)BIORAD公司的PT100上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積20μL，其中，2 μL10×PCR Buffer（含Mg2+），1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL 10 μmol/L SSR 引物，0.1 μL Taq DNA聚合酶，4 μL DNA模板，剩余用ddH2O補(bǔ)全。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min，放入4℃冰箱備用。

用6%聚丙烯酰胺變性凝膠進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析，恒定功率為60 W。凝膠通過固定、水洗、銀染、顯影等步驟完成染色并于室溫干燥。在白熾燈下觀察電泳結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和掃描照相。

1.5 一致性檢測(cè)

將供試材料各隨機(jī)選取5株，用國(guó)家20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物篩選進(jìn)行一致性檢測(cè)。在每一個(gè)引物的譜帶上以多數(shù)單株（＞3株）有的帶型作為每一份材料的帶型。如果在每一份材料能找到20對(duì)引物都有確定帶型的單株，則將這些單株作為這份材料的代表株。如果用5株不能確定某個(gè)引物的帶型，則要擴(kuò)大到10株。如果在某份材料不能找到20對(duì)引物都有確定帶型的單株，則這份材料將沒有代表株。

1.6 數(shù)據(jù)分析

SSR擴(kuò)增帶型以0，1，9統(tǒng)計(jì)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。在相同遷移率位置上，有帶記為1，無(wú)帶記為0，缺失記為9。按Nei和Li的方法計(jì)算自交系間的遺傳相似系數(shù)：GGS＝2Nij/（Ni＋Nj）；遺傳距離：GGD＝1－GGS。其中，GGS為遺傳相似系數(shù)；Ni為 i品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)；Nj為j品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)；GGD為遺傳距離。按Smith等提供的公式計(jì)算多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC），即 PPIC＝1-∑fi2。按 UPGMA（Unweighted pair group method rithmetic averages）方法進(jìn)行聚類分析。所有數(shù)據(jù)處理均由ntsys-pc 2.10e和Excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分析

本研究首先采用建立國(guó)家玉米品種指紋庫(kù)的20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)52份山西省常引用和自選的糯玉米自交系進(jìn)行了一致性檢測(cè)，經(jīng)大量、反復(fù)篩選，確定了山西省38份糯玉米自交系的DNA模板。然后用49對(duì)引物對(duì)6份標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種和38份玉米自交系進(jìn)行擴(kuò)增。從表1可以看出，本研究所選用的覆蓋玉米全基因組的49對(duì)SSR引物在44份玉米自交系中均具有多態(tài)性，共檢測(cè)到294個(gè)等位基因，不同SSR位點(diǎn)所檢測(cè)到的等位基因?yàn)?～10個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)6個(gè)。檢測(cè)到等位基因最多（10個(gè)）的位點(diǎn)是umc2163，檢測(cè)到等位基因最少（3個(gè)）的位點(diǎn)是phi076，umc1279，bnlg1940。44份玉米自交系的PIC平均為 0.633，變幅為 0.223～0.836。

表1 49對(duì)SSR引物在44份自交系中的等位變異情況及多態(tài)性信息量

特有基因指在標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)中沒有且只有1個(gè) 供試自交系有的等位基因；稀有基因是指在標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)中沒有且2個(gè)以上供試自交系有的等位基因。從表1還可以看出，共檢測(cè)到稀有等位基因86個(gè)，特有等位基因32個(gè)。在phi080這個(gè)位點(diǎn)上存在稀有等位基因最多（5個(gè)），bnlg1450和umc1018位點(diǎn)上存在的特有等位基因較多，均為3個(gè)。表2統(tǒng)計(jì)的是糯玉米自交系材料中含有特有和稀有等位基因的數(shù)量。

從表2可以看出，朱子糯、羅糯米含有特有等位基因數(shù)分別為5，4個(gè)；山黑M，3B含有稀有等位基因分別為18，17個(gè)。這說明山西省糯玉米自交系中含有較多的稀有和特有等位基因。

表2 38份糯玉米自交系中特有和稀有等位基因數(shù)

2.2 聚類分析

根據(jù)SSR數(shù)據(jù)得出，38份糯玉米自交系的遺傳相似系數(shù)在0.69～0.94之間。自交系丹340和 XN-1，05-34和 Mo17，05-774和 Mo17 之間的遺傳相似系數(shù)較小，為0.69；自交系L2與L4間遺傳相似系數(shù)為0.94，北珍和早M的遺傳相似系數(shù)為0.93。以SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)建立矩陣，利用ntsys-pc2.10e數(shù)據(jù)分析軟件，用UPGMA進(jìn)行聚類分析，建立樹狀聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數(shù)約為0.77時(shí)，44份自交系很明顯被分為8大類群。

從表3可以看出，各類群包括的自交系主要是：第1類群為以黃早4為代表的含有唐四平頭血緣的自交系，共6份；第2類群是山西群1，共1份；第3類群為以丹340為代表的旅大紅骨群，共8份；第4類群是以Mo17為代表的Lancaster群；第5類群為山西群2，共23份；第6類群是以B73為代表的Reid群；第7類群為以掖478為代表的PA群，共3份；第8類群為齊319的PB群（表3）。從表3還可以看出，沒有1份糯玉米自交系劃分在Lancaster群、Reid群和PB群中。

表3 44份糯玉米自交系的SSR標(biāo)記聚類結(jié)果

3 討論

很多自交系雖然經(jīng)過了多代選擇，在形態(tài)上趨于一致，但在遺傳上還存在異質(zhì)性，嚴(yán)重影響統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，本研究首先用20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物進(jìn)行試驗(yàn)材料的一致性檢測(cè)，通過一致性檢測(cè)可以有效地避免上述問題出現(xiàn)，減少數(shù)據(jù)誤差。

糯玉米種質(zhì)是受隱性突變基因（wxwx）控制的一個(gè)普通玉米突變類型。糯玉米種質(zhì)與普通玉米的最大區(qū)別是糯與非糯的差異，即由該基因所控制的表型性狀的差異，而該基因位于第9染色體上。結(jié)果表明，本研究選用的分布于玉米的整個(gè)基因組的49對(duì)SSR引物在普通玉米自交系與糯玉米自交系中均檢測(cè)到等位變異的存在。這說明2類種質(zhì)的遺傳差異不僅僅是限于該糯性基因位點(diǎn)，而是遍布整個(gè)基因組的。這進(jìn)一步證明了SSR標(biāo)記是鑒定糯玉米種質(zhì)資源親緣關(guān)系的一條有效途徑。

劉雪[11]將70對(duì)SSR引物在44份地方品種中檢測(cè)到的等位基因數(shù)目和在12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)自交系中檢測(cè)到的等位基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在每個(gè)群體中都有一些在標(biāo)準(zhǔn)自交系中未能檢測(cè)到的稀有等位基因，在陜西省的白烏龍?jiān)缛后w中發(fā)現(xiàn)的稀有等位基因數(shù)最多（16個(gè)）。段運(yùn)平等[12]在13份國(guó)內(nèi)適應(yīng)群體中發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)群體所特有的等位基因13個(gè)。本研究應(yīng)用SSR技術(shù)分析山西省38份糯玉米自交系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)材料上都能檢測(cè)到很多稀有等位基因，總共檢測(cè)出86個(gè)稀有等位基因；在16份材料中檢測(cè)到特有等位基因，共檢測(cè)出32個(gè)特有等位基因。這說明山西糯玉米自交系遺傳多樣性非常豐富，很多自交系具有頻率很高的獨(dú)特基因?？梢猿醪秸J(rèn)為，具有特異等位基因的這些自交系有可能作為山西省核心種質(zhì)的標(biāo)志，在一定程度上代表了山西糯玉米自交系的分子指紋特征。

所選用的 38份材料的遺傳相似系數(shù)在0.69～0.94之間，說明多數(shù)材料間具有一定的遺傳差異。山西糯玉米自交系分為5大類，其中，有2類明顯與普通玉米的6大類群不在一類，以玉F為首的一類中含有豐富的山西省本地糯玉米資源，這就為育種者提供了新的育種方向，可以培育Lancaster群、Reid群和PB群的糯玉米自交系，也可通過本地類與其他玉米優(yōu)勢(shì)群系雜交培育新的雜交種。

綜上所述，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是在DNA水平上明晰糯玉米種質(zhì)遺傳多樣性水平，并對(duì)其進(jìn)行遺傳構(gòu)成分析和類群劃分的有效手段。山西省糯玉米自交系遺傳多樣性非常豐富，有許多特有的等位基因，它們可能具有一定的特異性，對(duì)于拓寬種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)可能會(huì)起很大的作用，應(yīng)引起育種家的高度重視。而且，很多山西省糯玉米自交系構(gòu)成了獨(dú)特的一個(gè)類群，有可能形成新的糯玉米雜優(yōu)模式。

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