駢躍斌 ，許 晶 ，武巖軍 ，王 華 ，古曉紅

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

玉米種質(zhì)資源是人類(lèi)寶貴的物質(zhì)財(cái)富，大量的種質(zhì)資源是開(kāi)展玉米育種的基礎(chǔ)[1-2]。雜種優(yōu)勢(shì)是玉米品種選育的基礎(chǔ)理論依據(jù)，雜種優(yōu)勢(shì)群及雜種優(yōu)勢(shì)模式的概念已為玉米工作者普遍接受。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，育種家們通過(guò)對(duì)不同時(shí)期雜交種中主要親本所占比例的估算，對(duì)我國(guó)的玉米種質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了探索，通過(guò)種質(zhì)系譜或地理來(lái)源分析，對(duì)生產(chǎn)上利用的自交系初步進(jìn)行了類(lèi)群劃分，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為評(píng)價(jià)玉米種質(zhì)基礎(chǔ)提供了新手段[3-6]。

玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分與建立，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外玉米育種家們研究的熱點(diǎn)。這一研究有利于拓寬種質(zhì)資源和克服種質(zhì)資源的脆弱性，尤其對(duì)克服雜交組合組配的盲目性和提高育種效率至關(guān)重要[7-8]。

SSR標(biāo)記亦稱(chēng)微衛(wèi)星，是指由2～6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)組成的短片段，是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種新型遺傳標(biāo)記。研究表明，SSR標(biāo)記可有效地應(yīng)用于玉米種質(zhì)的遺傳變異研究及類(lèi)群劃分[9-12]。李新海等[13]將SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于我國(guó)玉米自交系的遺傳變異研究，袁力行等[14]用66對(duì)SSR引物將29份玉米自交系劃分為5個(gè)類(lèi)群。

本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)32份玉米自交系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分，旨在為玉米分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

32份玉米自交系材料（表1），均來(lái)自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。

表1 32份供試玉米自交系

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB提取法對(duì)DNA進(jìn)行提取。（1）采用沙培法，將自交系材料置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待其長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，剪其新鮮黃化苗3 cm，分別裝入2 mL離心管中，于液氮中迅速研磨成粉末；（2）加入CTAB提取緩沖液，65℃保溫30 min；（3）取出離心管，冷卻片刻，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），搖床振蕩10 min；（4）在室溫下10 000 r/min離心10 min，取上清液并加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），搖床振蕩 10 min；（5）在室溫下10 000 r/min離心10 min，取上清液并加入0.8倍體積的異丙醇，小心搖勻至有白色沉淀出現(xiàn)；（6）4 ℃下 10 000 r/min 離心 5 min，棄上清液；（7）加入75%乙醇洗滌2次，離心后倒去乙醇，風(fēng)干DNA；（8）加入 R40，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA濃度的測(cè)定及模板的制備 每管吸取提取的DNA 2 μL，用ddH2O稀釋至200 μL，在蛋白質(zhì)核酸定量測(cè)定儀上分別測(cè)定其濃度和純度，然后根據(jù)測(cè)定的濃度值配制成0.02 μg/μL的工作液。

1.2.3 SSR反應(yīng)體系 15 μL反應(yīng)體系包括：5 μLDNA 模板，0.2 μLTaq 聚合酶，10×Buffer，（0.75＋0.75）μLSSR 引物，6.4 μLddH2O。

1.2.4 SSR反應(yīng)程序 PCR反應(yīng)在PTC-100PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，94℃變性 1 min，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸5 min。

1.2.5 電泳 在擴(kuò)增產(chǎn)物中分別加入8 μL變性緩沖液，95℃變性7 min后，在6%聚丙烯酰胺變性膠上電泳。預(yù)電泳1 500 V 30 min，電泳1 500 V1 h。

1.2.6 染色 脫色與固定：電泳后，將膠板放入10%的冰乙酸固定液中，搖床搖20 min，直至指示劑藍(lán)色褪去。漂洗：將膠板從固定液中取出，瀝干，用雙蒸水洗2次，徹底去除殘余的固定液。染色：將沖洗后的膠板放入銀染液中，輕搖30 min。過(guò)水：將銀染過(guò)的膠板取出，瀝干，用雙蒸水快速充分過(guò)水10 s，去除銀染液。顯影：將膠板放入顯影液中，先用手搖幾下，然后再在搖床上搖蕩，直至DNA條帶現(xiàn)出為止。定影：將膠板從顯影液中取出，瀝干，放入固定液中5 min。然后用大量的水沖洗膠板，除掉殘留的顯影液，待晾干后進(jìn)行掃描。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 SSR產(chǎn)物銀染結(jié)果，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。利用NTSYS-peversion 2.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，按UPGMA方法對(duì)供試自交系進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 24對(duì)SSR引物對(duì)32份玉米自交系的檢測(cè)結(jié)果

以4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)自交系、28份自選自交系為材料，進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，從40對(duì)SSR引物中篩選出24對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，且24對(duì)引物在玉米10條染色體上均有分布。

從表2可看出，在供試材料中共檢出165個(gè)等位基因變異，每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因3～12個(gè)，平均為6.875個(gè)。

2.2 32份玉米自交系的聚類(lèi)分析

用SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)為原始數(shù)據(jù)，利用NTSYS-peversion 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，按UPGMA方法對(duì)供試玉米自交系進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖1），根據(jù)得出的遺傳距離、相似系數(shù)可以將32份自交系分為4個(gè)類(lèi)群：自交系莫17，Q625，Q835，Q601，Q741，Q801，3412 為第 1 大類(lèi)群，該類(lèi)群中含有標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種莫17，應(yīng)屬于Lancaster群；自交系丹 340，Q643，Q708，001A，9248 為第2大類(lèi)群，該類(lèi)群中含有標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種丹340，應(yīng)屬于旅大紅骨群；自交系黃早4，Q1261，113，918，P536，9249，Q639為第3大類(lèi)群，該類(lèi)群中含有標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種黃早4，應(yīng)屬于塘四平頭群；自交系478，K002，A1，Q710，112，Q622，100G，919，Q619，P401，Q702，強(qiáng) B，111 為第 4 大類(lèi)群，該類(lèi)群中含有標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種478，應(yīng)屬于Reid群。

表2 24對(duì)SSR引物在32份玉米自交系中檢測(cè)到的等位基因數(shù)

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)中所用標(biāo)記的數(shù)目及在染色體上的覆蓋程度決定了遺傳多樣性分析的可靠性。本試驗(yàn)在供試材料中共檢測(cè)出165個(gè)等位基因變異，每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因3～12個(gè)，平均為6.875個(gè)。32份玉米自交系的遺傳距離變幅為0.77～0.95，遺傳距離變幅較大，平均遺傳距離也較大，表明供試自交系的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

SSR聚類(lèi)結(jié)果與自交系已知系譜關(guān)系具有較好的一致性。從雜種優(yōu)勢(shì)利用的實(shí)踐來(lái)看，強(qiáng)盛 16號(hào)（Q835×Q639）、強(qiáng)盛 11號(hào)（Q625×Q643）、強(qiáng)盛 62號(hào)（3412×9248）、晉單 56號(hào)（Q801×Q625）等多個(gè)已在生產(chǎn)上大面積推廣的雜交種，其雙親均屬于不同的類(lèi)群，而在同一類(lèi)群內(nèi)幾乎沒(méi)有組配出高產(chǎn)雜交種。這充分說(shuō)明了聚類(lèi)結(jié)果的合理性，SSR分子標(biāo)記是進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分的有效分子標(biāo)記。

對(duì)親緣關(guān)系不清的自交系劃分雜種優(yōu)勢(shì)群，可避免盲目性，有目的地選配雜交組合，從總體上提高育種水平。

在今后的研究中，如果將我國(guó)主要雜種優(yōu)勢(shì)群的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)種加入，選擇少數(shù)與雜種優(yōu)勢(shì)QTL緊密連鎖的、多態(tài)性好的引物，再輔以多年多點(diǎn)雜交組合的田間鑒定，將會(huì)更加經(jīng)濟(jì)有效、客觀合理地對(duì)玉米種質(zhì)的雜種優(yōu)勢(shì)群進(jìn)行有效的劃分。

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