梁麗娟，黃 薇

(天津醫(yī)藥集團(tuán)津康制藥有限公司，天津 300270)

自從SNARE蛋白被發(fā)現(xiàn)以后，SNAREs就作為細(xì)胞膜融合蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵組分而獲得普遍認(rèn)同。盡管不同SNARE蛋白的基因組成序列存在差異，但是新型可設(shè)計(jì)的膜體系廣泛地被應(yīng)用，均涉及細(xì)胞生長、膜修復(fù)、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和突觸傳遞等許多方面的細(xì)胞膜融合活動(dòng)［1］。SNARE能夠啟動(dòng)囊泡融合，參與蛋白質(zhì)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)性和非調(diào)節(jié)性囊泡的胞吐活動(dòng)的激活和融合過程。俄亥俄州立大學(xué)的Dennis Bong教授認(rèn)為，蛋白質(zhì)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)等可以很好地控制化學(xué)分子釋放到目標(biāo)分子，可以用于與生物科技和材料科學(xué)領(lǐng)域［2］。SNARE蛋白具有大約60個(gè)氨基酸殘基組成的細(xì)分子膜蛋白，SNARE蛋白組成了一個(gè)蛋白質(zhì)超家族，在哺乳動(dòng)物中超過35個(gè)。根據(jù)分布位置分為t－SNARE和v－SNARE。Rothman組和Scheller組發(fā)現(xiàn)syntaxin和SNAP－25具有t－SNARE的特性。而位于突觸囊泡膜上的VAMPs能特異性的降解SNARE蛋白的蛋白酶［3］。VAMP、syntaxin和 SNAP－25可以分別被破傷風(fēng)毒素、肉毒毒素和金屬蛋白酶特異性的降解，從而不可逆地抑制突觸傳遞。體外重構(gòu)實(shí)驗(yàn)表明，分別含有v－SNARE和t－SNARE蛋白的脂質(zhì)體能夠融合。基于快速冰凍蝕刻電子顯微鏡技術(shù)和X－射線衍射技術(shù)證明VAMP與syntaxin和SNAP－25形成將囊泡與質(zhì)膜拉近并促進(jìn)囊泡融合超螺旋核心復(fù)合體。

目前認(rèn)為，SNARE核心復(fù)合物是突觸囊泡胞吐過程中的核心成分，而且參與幾乎所有分泌細(xì)胞的胞吐過程。其由三種蛋白質(zhì)組成:位于突觸前膜的 t－SNARE(target－SNARE)，包括syntaxin和突觸小體相關(guān)蛋白(synaptosome－associated protein of 25 kD，SNAP－25);位于突觸囊泡膜上的v－SNARE(vesicle－SNARE)，為突觸囊泡蛋白/突觸囊泡相關(guān)膜蛋白vesicle－associated membrane protein，VAMP/synaptobrevin)［4］。SNARE的命名源于其最初是作為N－甲基馬來酰胺敏感因子(N－ethyl－maleimide－sensitivefactor，NSF)和可溶性 NSF附著蛋白(soluble NSFattachment proteins，SNAP)的膜受體，即 SNAPs蛋白受體。Syntaxin和VAMP均通過羧基末端的跨膜區(qū)分別錨定于突觸前膜和突觸囊泡膜上，而SNAP－25無跨膜區(qū)，其通過其中間區(qū)4個(gè)半胱氨酸殘基中的脂酰基錨定于突觸前膜。目前已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)30多種SNARE超家族成員，多數(shù)成員在分泌過程中都有其特異的亞細(xì)胞定位。生化研究結(jié)果顯示，重組syntaxin、SNAP－25和VAMP三者結(jié)構(gòu)中的僅螺旋形成區(qū)(coiled－coil domain)可形成一個(gè)穩(wěn)定的核心復(fù)合物(core complex)，該核心復(fù)合物可抵抗SDS的變性作用，蛋白酶的水解以及梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的裂解作用，其熱穩(wěn)定性可達(dá)到約90℃。SNARE三聚體核心復(fù)合物的親和力很高，但核心復(fù)合物相互作用的解離常數(shù)尚未確定［5－7］。

SNARE復(fù)合物是所有膜融合過程所需的核心蛋白復(fù)合物，SNARE蛋白的作用是保證識別的特異性，并介導(dǎo)運(yùn)輸小泡與目標(biāo)膜的融合。在神經(jīng)系統(tǒng)中SNARE復(fù)合物介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)囊泡在突觸前膜的搭靠與融合過程，SNARE復(fù)合物的調(diào)節(jié)一直都是突觸傳遞研究中的熱點(diǎn)。SNAP－29被認(rèn)為是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的target－SNARE蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)SNARE依賴的膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其家族成員有 SNAP－25和SNAP－23。SNAP29在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中是一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)分子，其調(diào)節(jié)作用可能在于其抑制了突觸囊泡(SV)融合后SNARE復(fù)合物的解聚，阻礙SNARE蛋白參與到新的囊泡融合過程中，從而減慢囊泡循環(huán)翻新效率，最終對突觸傳遞起到抑制作用［8－10］。

1 SNARE蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

SNARE蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)都具有60個(gè)氨基酸殘基組成的 SNARE的模體。有 syntaxin的氨基末端域和SNAP－25的中間中櫚酸?；瘏^(qū)域。VAMP氨基末端的富含脯氨酸域以及 syntaxin和 VAMP的跨膜區(qū)。Syntaxin的長氨基末端具有三個(gè)α－螺旋，稱為Habc。Habc可以與其羧基末端SNARE模體的α－螺旋形成封閉的結(jié)構(gòu)。Habc可以減少溶液中SNARE蛋白核心復(fù)合體的形成，抑制具有SNARE蛋白的脂質(zhì)體的融合。Munc－18能夠識別和結(jié)合 syntaxin、Habc結(jié)構(gòu)域和SNARE模體α－螺旋所形成的封閉結(jié)構(gòu)。當(dāng)Munc－18的構(gòu)象變化時(shí)，能夠使 syntaxin的 Habc與其自身SNARE模體 α－螺旋解離，形成開放結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)SNARE蛋白的聚合物反應(yīng)。因此，syntaxin的氨基末端域?qū)δ遗菁せ詈腿诤线^程的調(diào)控具有重要的意義，也是SNARE蛋白之所以成為調(diào)節(jié)性胞吐過程膜融合基本分子構(gòu)建的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［11］。盡管SNAP－25兩個(gè)α－螺旋中間的連接區(qū)域即富含半胱氨酸的中間結(jié)構(gòu)域?qū)ζ淠遗萑诤蟻碚f不是必要的，但連接區(qū)的四個(gè)半胱氨酸殘基棕櫚化后能夠?qū)NAP－25結(jié)合到細(xì)胞膜上，提高了SNAP－25的局部濃度，因而形成了足夠的SNARE復(fù)合物，對調(diào)節(jié)性分泌可能很重要。見圖1。

2 SNARE核心復(fù)合體與囊泡激活及膜融合

囊泡胞吐過程的膜融合由SNARE蛋白質(zhì)介導(dǎo)。在SNARE模體的介導(dǎo)下，各SNARE蛋白聚合形成核心復(fù)合體。溶液中游離的SNARE模體為無定型結(jié)構(gòu)，當(dāng)適合的SNARE模體混合在一起時(shí)就能自發(fā)地聚合形成平行排列的超螺旋束。Synaptobrevin和syntaxin具有一個(gè)SNARE模體;SNAP－25有兩個(gè)SNARE模體;Synaptobrevin、syntaxin及SNAP－25按1∶1∶1的比例形成三聚體，這三類蛋白的四個(gè)SNARE模體的α－螺旋束平行排列聚合形成核心復(fù)合物。SNARE蛋白的聚合從遠(yuǎn)離膜的氨基末端開始，以閉合拉鏈的形式向靠近膜的羧基端發(fā)展，通過synaptobrevin及syntaxin的連接區(qū)和跨膜域的傳遞，是囊泡膜和靶膜變形彎曲并相互靠攏，最終促使兩膜融合。此為“拉鏈”模型。SNARE蛋白聚合過程中，構(gòu)象發(fā)生改變并且釋放能量，所釋放的能量用于克服囊泡膜與靶膜融合時(shí)的能量障礙。SNARE蛋白的聚合是一個(gè)可逆的過程，且存在著緊密結(jié)合和松散結(jié)合兩種物理狀態(tài)。緊密結(jié)合的SNARE蛋白聚合體對梭菌毒素不敏感，而結(jié)構(gòu)松散結(jié)合的SNARE蛋白聚合體對梭菌毒素敏感且為可逆的結(jié)合狀態(tài)。多個(gè)SNARE蛋白復(fù)合體或者SNARE蛋白多聚體與磷脂形成融合孔。然后，SNARE蛋白擴(kuò)散，融合孔擴(kuò)大。融合孔形成后，t－SNARE和v－SNARE插在同一膜上，成為同位 －SNARE聚合體，NSF水解cis－SNARE復(fù)合物，是各SNARE蛋白游離開來，以便SNARE蛋白的循環(huán)利用。Ca2+為囊泡融合過程的觸發(fā)信號，synaptobrevin是 Ca2+感受器分子［12，13］。Ca2+、蛋白激酶、G 蛋白、Munc18 和 synaptatagmin等還可能參與對膜融合和融合孔動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)。SNARE核心復(fù)合物具有15個(gè)疏水層和一個(gè)親水層。中間層為由親水性的3個(gè)谷氨酰胺和一個(gè)精氨酸殘基組成的離子層。屬于t－SNARE蛋白的 syntaxin和SNAP－25形成中間層anjisuan殘基為谷氨酰胺殘基，因而稱為Q－SNARE;v－SNARE的synaptobrevin為精氨酸殘基，也稱為R－SNARE。SNARE聚合物非常穩(wěn)定，能夠抵抗SDS的滅活作用、蛋白酶的消化作用和神經(jīng)毒素的裂解，并且有高達(dá)大約90℃的熱穩(wěn)定性［14－16］。因而，核心復(fù)合體的各個(gè) SNARE模體相互作用力很強(qiáng)大。SNARE核心復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)揭示這些相互作用力，包括疏水性相互作用、氨基酸殘基側(cè)鏈的氫鍵和鹽橋作用力。

3 SNARE蛋白復(fù)合體的解離

囊泡與靶膜融合后，各SNARE蛋白位于同一膜上。同位－SNARE必須解聚成為有力的單體才能用于新的囊泡激活和融合的過程，SNARE蛋白的循環(huán)利用可能是保證分泌細(xì)胞對高強(qiáng)度的重復(fù)刺激做出反應(yīng)的重要因素之一。同位的SNARE解聚是由NSF完成。胞漿中的NSF在其適配蛋白α/β－SNAPs的協(xié)助下，水解ATP，將同位－SNARE聚合體解離。酵母的NSF/SNAPs同系物 sec18/sec17可以解聚異位 －SNARE［17，18］。

圖1 SNARE主要的結(jié)構(gòu)域

4 囊泡胞吐的分子機(jī)制

Syntaxin與n－sec1結(jié)合，然后形成核心復(fù)合物。Rab可能幫助Syntaxin與n－sec1的分離，便于后續(xù)的三種神經(jīng)元的 SNAREs、syntaxin和 SNAP－25結(jié)合。Ca2+引發(fā)了卷曲復(fù)合物的全部拉鏈，這導(dǎo)致膜融合和囊泡的內(nèi)容物釋放［13］。在融合事件發(fā)生后，α－SNAP和NSF聚集，以及后續(xù)NSF水解ATP會引起SNARE的解聚。Syntaxin、VAMP和SNAP－25回收用作第二次胞吐。見圖2。

5 SNARE介導(dǎo)的脂質(zhì)融合

圖2 囊泡胞吐的分子機(jī)制

圖3 SNARE介導(dǎo)的脂質(zhì)融合

首先是囊泡膜和質(zhì)膜相互靠近，但是SNARE沒有接觸。SNARE從氨基端啟動(dòng)拉鏈，引起兩個(gè)膜靠近。拉鏈?zhǔn)站o，引膜的曲度和側(cè)面張力增加，展現(xiàn)了雙分子層的本質(zhì)。當(dāng)間距足夠小時(shí)自發(fā)的半融合。側(cè)面的張力使膜斷裂，產(chǎn)生融合孔，融合孔擴(kuò)張，膜塌陷。見圖3。總之，SNARE蛋白及其復(fù)合物由其介導(dǎo)的運(yùn)輸囊泡膜與靶膜的錨靠、融合確保了各種胞內(nèi)蛋白的定向運(yùn)輸，從而保證了細(xì)胞生命活動(dòng)的正常進(jìn)行;同時(shí)通過對其結(jié)構(gòu)及融合解離機(jī)制的深入研究，科研工作者在生物科技、生物醫(yī)藥和材料科學(xué)領(lǐng)域會有越來越令人興奮的發(fā)現(xiàn)，尤其是在現(xiàn)代新藥研究與開發(fā)過程中，其作為靶向藥物的藥物靶點(diǎn)的探索會越來越受到科研領(lǐng)域的矚目。

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