李曉婷 王友翠 夏冠男 王廷華 齊建國

（四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041）

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，其高度分化，形態(tài)多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在生理功能上具有接受刺激、傳導(dǎo)沖動和整合信息的能力。腦功能的運行需要神經(jīng)元通過這一復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行信息傳遞。突觸是實現(xiàn)這一傳遞的特殊結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)元發(fā)育過程中，細胞的生存、生長、遷移、與其他細胞建立功能性聯(lián)系，以及神經(jīng)再生過程中軸突的生長等，除了受內(nèi)源性程序的調(diào)控，還受到局部環(huán)境因素的影響，例如神經(jīng)營養(yǎng)因子的維持和促生長功能。

proBDNF是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 的前體，傳統(tǒng)的觀點認為這些神經(jīng)營養(yǎng)因子前體是無活性的，但是2001 年，Lee等科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子前體可以促進細胞凋亡［10］。此后的研究發(fā)現(xiàn)，proBDNF的促細胞凋亡作用是由p75NTR 介導(dǎo)的。此外，Henry K Teng 等［11］發(fā) 現(xiàn)，proBDNF 能 夠促進體外培養(yǎng)的表達p75和sortilin的神經(jīng)元凋亡。

P75NTR（p75neurotrophin receptor），為一種Ⅳ型膜蛋白，分子量75kD，是神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員。Sortilin，相對分子量95kD，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，為已知的第一個不屬于G－蛋白偶聯(lián)受體超家族的跨膜神經(jīng)肽受體，在體內(nèi)廣泛分布。但是其在體內(nèi)的作用既不是合成肽類，也不是反應(yīng)肽類。因此，我們建立體外神經(jīng)元發(fā)育的模型，研究其生長發(fā)育過程中p75、sortilin的表達變化。為今后進一步研究proBDNF對神經(jīng)元發(fā)育的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

采用新生0～1h的SD 大鼠，由四川大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及其配

DMEM／F12（1∶1，Gibco）；B27（Gibco），胎牛血清（Hyclone），多聚賴氨酸（Invitrogen），青鏈霉素混合液，谷氨酰胺，胰酶等單克隆p75（MC192），sortilin抗體由澳大利亞周新福教授饋贈；tau－1 抗體購自，特異性識別軸突；Neun抗體，神經(jīng)元的特異性抗體。10%培養(yǎng)基：DMEM／F12 88ml，雙抗（青、鏈霉素）各1ml，F(xiàn)BS 10 ml，－20℃儲存。無血清培養(yǎng)基：neurobasal 97ml，雙抗（青、鏈霉素）各1ml，B27 2 ml，－20℃儲 存。多聚賴氨酸：Poly－D－Lysine（PDL），濃度為1mg／ml，工作液濃度為0.1mg／ml。

1.3 新生大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)

提前一天做好準備工作，取新生0～1h 的SD大鼠，浸泡75%酒精30s～1min消毒，斷頭（以上操作在細胞培養(yǎng)間進行）。將鼠腦置于高溫消毒后盛有預(yù)冷D－Hanks液的培養(yǎng)皿中，放進超凈工作臺。左手用眼科鑷夾住兩眼睛處固定腦袋，右手用眼科剪分層依次剪開皮膚、顱骨，從人字縫及矢狀縫將頭皮和顱軟骨組織分開，暴露出兩側(cè)大腦半球、嗅球及小腦。鑷子與腦干垂直、右手取出兩大腦半球，用冷的D－Hanks液將殘留血液沖洗干凈，置于另一裝有預(yù)冷D－Hanks液的培養(yǎng)皿中，放于解剖顯微鏡下。用顯微鑷輕輕剔除腦膜，小心分開皮層，暴露并取出雙側(cè)海馬組織，在D－Hanks液中漂洗后放入15ml離心管或1.5ml EP 管中，加入孵育好的10%FBS＋DMEM／F12培養(yǎng)基，一個大腦3ml，吹打10～20次制成細胞懸液，靜置于試管架上3～5min，使較大組織塊沉淀下來。取上層懸液，進行計數(shù)后按照實驗要求以1×105／mL 密度接種于包被好的培養(yǎng)板或玻片上。將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h 后全量換液。以后根據(jù)細胞的生長情況及實驗要求，每3d半量或全量換液，同時在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況。換液時注意要提前把培養(yǎng)基放進培養(yǎng)箱孵育然后再進行換液。

1.4 神經(jīng)元鑒定

培養(yǎng)3d時細胞已具有一定的形態(tài)，因此本實驗選取3d的細胞進行鑒定，采用neun細胞免疫組織化學(xué)法。Neun陽性染色位于神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，多為棕色或棕紅色。

倒置相差顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)。本實驗中，所有著色細胞，代表細胞總數(shù)。根據(jù)公式計算出神經(jīng)元純度：［neun 陽性細胞數(shù)／著色細胞數(shù)（總細胞數(shù)）］×100%＝神經(jīng)元陽性率（即神經(jīng)元純度）。

1.5 神經(jīng)元發(fā)育過程中p75和sortilin的表達

根據(jù)實驗要求選取不同時間點、不同條件的細胞取至試驗臺，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)熱的0.01 M PBS漂洗兩次（不要把PBS 直接加到細胞上，也不要使細胞干掉）；然后用4%多聚甲醛固定30 min（多甲在37℃預(yù)熱后再用，防止溫度差異導(dǎo)致細胞脫落）；0.01M PBS充分漂洗；按二步法分別行免疫細胞化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的生長情況

普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，接種0h，大多數(shù)細胞呈圓球型懸浮于培養(yǎng)基中，折光性較好，單個散在分布。接種12～24h貼壁后，神經(jīng)元周圍長出類似于偽足的包裹體，邊界不整齊；培養(yǎng)3d，包裹體周圍開始有一些向外生長的突起，其中一個突起較其它突起迅速生長延伸，發(fā)育成較長的軸突，其余幾個短小的突起則形成樹突，神經(jīng)元之間逐漸形成網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)7d，軸突繼續(xù)延伸，樹突分支增多，神經(jīng)元軸突和樹突相互交叉、連接，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

2.2 neun免疫組化染色鑒定，經(jīng)計算陽性率可達到90%以上。Neun 陽性染色位于神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，多為棕色或棕紅色。根據(jù)公式計算出神經(jīng)元純度：［neun陽性細胞數(shù)／著色細胞數(shù)（總細胞數(shù)）］×100%＝神經(jīng)元陽性率（即神經(jīng)元純度）。

2.3 細胞免疫組化

經(jīng)細胞免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，p75NTR、sortilin在神經(jīng)元發(fā)育過程中均有表達。

3 討論

神經(jīng)元的體外培養(yǎng)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重要技術(shù)。海馬做為邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，具有高度序化的板層結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元高度集中并相對獨立的特點，而且在學(xué)習(xí)、記憶、認知、情緒反應(yīng)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理變化有情方面具有重要的作用，因此本次實驗選取體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元作為模型。

目前國內(nèi)外對于海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)，傳統(tǒng)方法多選用胎鼠進行取材。但由于胎鼠的胎齡不容易掌握，某些核團及功能區(qū)的解剖位置不易準確定位，因此選擇新生鼠來代替胎鼠進行海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)的取材。且近年來選擇新生鼠進行神經(jīng)元原代培養(yǎng)的實驗日漸增多［8］。

新生鼠與胎鼠相比，神經(jīng)元分化程度高，神經(jīng)突起發(fā)育成熟，神經(jīng)元之間以及與纖維組織之間的連接比較緊密。而且有研究表明，通過投射電鏡觀察出生1d的新生大鼠海馬，偶見神經(jīng)元突觸，且結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全、突觸連接部位很短、突觸小泡極少［7］。因此為提高神經(jīng)元的純度以及存活率，我們參照原有的，比較權(quán)威的培養(yǎng)方法［4］，取出生0～1h的SD大鼠海馬組織，在解剖顯微鏡下剔除腦膜，精確定位取材，以保證組織的純度。經(jīng)機械吹打10～20次，使組織分散成單細胞懸液。以1×105／mL 密度種植于含10% 胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中，24 h后全量換液。培養(yǎng)3d后，經(jīng)neun鑒定，神經(jīng)元的純度可以達到80%以上。

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