趙永華 邱 方 孟 偉

河北省廊坊市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北廊坊 065000

嚴(yán)重?zé)齻蟮牟±砩矸磻?yīng)幾乎涉及全身所有組織和器官，燒傷不僅使局部組織受到破壞，還存在著廣泛的組織缺血缺氧性損害，使各種器官不同程度受損，而燒傷后胃腸道損傷也是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著對(duì)凋亡研究的不斷深入，Zhang等[1]認(rèn)為，細(xì)胞凋亡在維持腸黏膜上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。谷氨酰胺（Gln）是條件必須氨基酸，對(duì)人體非常重要，參與多種代謝必需物質(zhì)的合成，并為腸黏膜和其他增生活躍的細(xì)胞（如免疫細(xì)胞）提供主要能量[2-3]。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷后Gln被迅速消耗，機(jī)體內(nèi)Gln減少[4]，而Gln缺乏將會(huì)引起腸黏膜細(xì)胞凋亡增加和增殖減少，從而導(dǎo)致腸黏膜萎縮，腸屏障功能受損，甚至因此引起全身炎癥應(yīng)答綜合征（SIRS）和多器官功能衰竭綜合征（MOF）[5]。本研究選用大鼠25%總體表面積（TBSA）Ⅲ度燒傷模型，經(jīng)給予Gln強(qiáng)化的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)來(lái)觀察其對(duì)腸黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康成年Wistar大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）50只，雌雄不限，體重280～300 g。

1.2 試劑

腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑能全力（Nutricia公司），谷氨酰胺（重慶藥友制藥），DAO檢測(cè)試劑及標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），TUNEL檢測(cè)試劑盒（Roche公司）。

1.3 方法

1.3.1 燙傷模型的制作 健康成年Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組，即腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組（EN組）和腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)加谷氨酰胺補(bǔ)給組 （EN+Gln組），將兩組大鼠均制成燙傷模型，每組20只；另取10只作為傷前對(duì)照，制成假燙模型（假燙傷組），將其測(cè)得數(shù)據(jù)作為傷前參考值。大鼠燙傷前禁食12 h，予腹腔注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，稱(chēng)其體重后根據(jù)計(jì)算公式 S（cm2）=9.1×W（g）2/3（S 為體表面積，W 為體重） 確定 TBSA的25%面積。背部電推剃毛，將兩組動(dòng)物備皮部位置于90℃水中7 s，制備25%TBSA的燙傷模型（經(jīng)病理學(xué)的檢查證實(shí)）。傷后給予腹腔注射等滲鹽水50 mL/kg抗休克。將大鼠放入限制籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)液的配制與供給 給予同等熱量的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物，EN組給予腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑能全力，EN+Gln組在此基礎(chǔ)上添加Gln 0.3 g/（d·kg），傷后 4 h開(kāi)始灌喂?fàn)I養(yǎng)液。每日總熱量按文獻(xiàn)[6]報(bào)道的731.5 kJ/kg給予，每天計(jì)劃量分3～5次喂完，不限飲水。

1.3.3 標(biāo)本采集 于燙傷后24、72 h，EN組和EN+Gln組分別各取10只大鼠，氯胺酮麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌操作條件下剖開(kāi)腹腔，用去熱原空針抽取門(mén)靜脈血2 mL放入加入肝素的試管中，4℃3 000 rpm離心12 min，吸取上清液各1 mL，-70℃保存，待用。立即取距回盲部5 cm處回腸5 cm，用等滲鹽水（4℃）沖凈腸內(nèi)容物及黏液，取其中4 cm用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定后制成病理標(biāo)本；另外1 cm置入3%的戊二醛溶液（4℃）固定擬做透射電鏡檢查。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法 ①血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性測(cè)定：DAO測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]的方法。②小腸細(xì)胞凋亡的觀察：常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟入水，梯度乙醇水化，按照美國(guó)羅氏公司公司的TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。 光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI計(jì)算方法：計(jì)算每100個(gè)上皮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，每張切片各選4個(gè)視野，求其平均值。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)×100%。③常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，中性樹(shù)脂封片，采用 HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)觀測(cè)HE染色切片。④經(jīng)戊二醛、鋨酸雙固定，乙醇系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑浸透、包埋，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛電子染色，在JEM-100CX透射電鏡觀察腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二胺氧化酶活性的測(cè)定情況

燙傷后EN組和EN+Gln組大鼠血漿DAO活性較假燙傷組均升高（P<0.01）；EN+Gln組在 24、72h時(shí)血漿 DAO 活性明顯低于EN組（P<0.01），說(shuō)明補(bǔ)充Gln的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)能降低燙傷大鼠DAO活性。見(jiàn)表1。

表1 燙傷后各組大鼠DAO活性測(cè)定（±s，U/mL）

表1 燙傷后各組大鼠DAO活性測(cè)定（±s，U/mL）

注：與假燙傷組比較，aP<0.01；與EN組比較，bP<0.01

組別 只數(shù) 燙傷后時(shí)間（h）24 72假燙傷組EN組EN+Gln組10 20 20 0.61±0.12 2.01±0.12a 1.07±0.15ab 0.61±0.12 1.69±0.08a 0.87±0.10ab

2.2 小腸上皮細(xì)胞凋亡情況

燙傷后各組大鼠的AI均較假燙傷組高 （P<0.01），EN組和EN+Gln組72 h AI值均較24 h時(shí)下降，與EN組相比EN+Gln 組下降更明顯（P<0.01）。 見(jiàn)表 2，圖 1、2。

表2 燙傷后各組小腸上皮細(xì)胞凋亡情況（±s）

表2 燙傷后各組小腸上皮細(xì)胞凋亡情況（±s）

注：與假燙傷組比較，aP<0.01，bP<0.01；與EN組比較，cP<0.01

組別 只數(shù) 燙傷后時(shí)間（h）24 72假燙傷組EN組EN+Gln組20 20 10 4.40±0.13 15.15±0.26a 10.93±0.19bc 4.40±0.13 11.99±0.21a 8.20±0.74bc

2.3 小腸形態(tài)學(xué)情況

假燙傷組小腸黏膜絨毛呈指狀突起，絨毛較長(zhǎng)，中間有中央乳糜管，表面覆以柱狀上皮細(xì)胞，其腸腔面可見(jiàn)濃集的刷狀緣。EN組傷后24 h腸黏膜明顯萎縮，絨毛融合、壞死、脫落，腸腺消失，伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。EN+Gln組燙傷后24 h腸黏膜輕度萎縮，絨毛排列較規(guī)則，腸黏膜固有層完整，杯狀細(xì)胞增多，有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。EN+Gln組與EN組相比，腸絨毛高度及腸黏膜厚度均有所增加。燙傷后72 h，EN組與EN+Gln組腸黏膜損傷較24 h時(shí)有所恢復(fù)，但仍未恢復(fù)到正常，與EN組比較，EN+Gln組腸黏膜恢復(fù)明顯（P<0.05）。見(jiàn)表 3，圖 3、4。

表3 大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)測(cè)量情況（±s，μm）

表3 大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)測(cè)量情況（±s，μm）

注：與假燙傷組比較，*P<0.01，#P<0.05；與同時(shí)間點(diǎn) EN組比較，※P<0.05，▲P<0.01

組別 時(shí)間（h） 只數(shù) 腸絨毛高度 腸粘膜厚度假燙傷組EN組EN+Gln組24 72 24 72 10 20 20 20 20 268.5±7.3 189.3±8.1*196.2±8.4*197.1±9.7*※212.6±8.7*▲404.9±10.1 365.1±6.1*380.0±9.8*370.9±6.3*393.0±6.7#▲

2.4 腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

燙傷后24 h，EN組腸上皮細(xì)胞局部微絨毛腫脹，橋粒結(jié)構(gòu)張力微絲稀疏，核固縮，核異染色質(zhì)呈塊狀邊集，有些線(xiàn)粒體空化、嵴斷裂或缺失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。EN+Gln組腸上皮細(xì)胞微絨毛、細(xì)胞連接、線(xiàn)粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和核常染色質(zhì)分布基本正常。傷后72 h，EN+Gln組腸上皮細(xì)胞微絨毛和細(xì)胞連接局部結(jié)構(gòu)輕微異常（圖5），EN組腸上皮細(xì)胞微絨毛、細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)局部仍表現(xiàn)異常（圖6）。

3 討論

胃腸道黏膜是血流最豐富的部位，需要足夠的血流保證其正常的功能，同時(shí)其是缺血缺氧最敏感的部位，一旦出現(xiàn)血流灌注不足，胃腸道最易受累，腸屏障功能障礙也最先發(fā)生，而燒傷后由于大量液體外滲，導(dǎo)致血容量不足而休克，造成體內(nèi)的血液從新分布，優(yōu)先供應(yīng)心、腦、腎等重要器官，從而造成腸黏膜缺血缺氧，以及后期缺血再灌注和大量細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，造成腸黏膜的損傷，從而影響到腸屏障的功能。

DAO是腸黏膜細(xì)胞的標(biāo)志酶，存在于哺乳動(dòng)物小腸黏膜絨毛上層，其他組織和細(xì)胞中幾乎不存在DAO。生理狀況下，血漿中DAO活性很低，在腸黏膜受損時(shí)，腸黏膜上皮細(xì)胞受損壞死后DAO釋放增加，進(jìn)入淋巴管和血流，使血中DAO的含量升高而腸黏膜活性下降，其是反映小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能較理想的指標(biāo)[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)重燙傷后EN組和EN+Gln組DAO活性均比假燙傷組增高，燙傷72 h后兩組DAO活性均呈下降趨勢(shì)，但EN+Gln組下降更明顯，說(shuō)明Gln能使嚴(yán)重燙傷后血漿DAO活性下降，減少腸黏膜的損傷。Peng等[9]的研究表明，在應(yīng)用Gln后，治療組的血漿DAO活性降低，但14 d后仍高于正常水平，說(shuō)明應(yīng)用Gln雖減少了腸黏膜的損傷，但是不能治愈該損傷。本實(shí)驗(yàn)雖作用時(shí)間較短，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Peng等[9]相似。

細(xì)胞凋亡時(shí)鈣鎂依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶被激活，使DNA發(fā)生斷裂，產(chǎn)生3'-OH末端，故可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）介導(dǎo)將標(biāo)記的dUTP加到DNA分子有凹缺的3'-OH末端（TUNEL），從而檢測(cè)凋亡細(xì)胞，此方法是目前研究細(xì)胞凋亡的最常用的技術(shù)，具有高敏感性和特異性且能夠識(shí)別凋亡早期的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，燙傷后大鼠的腸黏膜AI值比假燙傷組高，說(shuō)明燙傷后大鼠的腸黏膜凋亡數(shù)量增加，小腸的萎縮與之有關(guān)；與EN組各時(shí)間點(diǎn)相比，EN+Gln組AI均降低，說(shuō)明Gln能促進(jìn)減少細(xì)胞凋亡。Kenji等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在內(nèi)毒素血癥的大鼠中應(yīng)用Gln能增加Bcl-2 mRNA表達(dá)并減少caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明Gln能抑制腸黏膜的細(xì)胞凋亡。Kana等[11]發(fā)現(xiàn)，出血性休克的大鼠上應(yīng)用Gln能夠保護(hù)腸黏膜細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡。Gln抑制細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制為：①Gln通過(guò)核酸合成的途徑抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]；②Gln增強(qiáng)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)；③Gln增加熱休克蛋白（Hsp70）的水平和提升谷胱甘肽（GSH）含量，兩者均具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]。

有研究表明，大鼠在嚴(yán)重的燙傷后腸絨毛的高度和腸黏膜的厚度均較正常大鼠低[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，燙傷后大鼠的腸黏膜厚度和腸絨毛的高度均低于正常組，EN+Gln組和EN組都有恢復(fù)于正常的趨勢(shì)，但在相同時(shí)間點(diǎn)EN+Gln組較EN組更接近正常值。Lü等[15]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給燒傷大鼠應(yīng)用Gln，對(duì)受損腸黏膜的血流、腸黏膜厚度和腸絨毛高度均有逆轉(zhuǎn)作用，說(shuō)明Gln可減輕燒傷后腸黏膜受損程度，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實(shí)，大鼠在嚴(yán)重燙傷后腸黏膜受到損傷，Gln強(qiáng)化的早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)能減少?lài)?yán)重燙傷大鼠的腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腸黏膜恢復(fù)，更好的維護(hù)腸黏膜屏障的作用，但是Gln保護(hù)燙傷后腸黏膜受損的具體機(jī)制尚不十分清楚，抑制細(xì)胞凋亡可能只是其作用機(jī)制之一。深入探討其機(jī)制并采取相應(yīng)的治療策略，將有助于控制嚴(yán)重燙傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）及多器官障礙綜合征（MODS）的發(fā)生，對(duì)降低并發(fā)癥、改善治療效果都具有重要的臨床意義。

[1]Zhang C，Sheng ZY，Hu S，et al.The influence of apoptosis of mucosal epithelial cells on intestinal barrier integrity after scald in rats[J].Burns，2002，28（8）：731-737.

[2]Fan J，Meng Q，Guo G，et al.Effects of enteral nutrition supplemented with glutamine on intestinal mucosal immunity in burned mice[J].Nutrition，2009，25（2）：233-239.

[3]Masafumi W，Hideki S，Yoshiyuki S， et al.Glutamine stimulates amino acid transport during ischemia/reperfusion in human intestinal epithelial cells[J].Journal of Surgical Research，2005，123（1）：75–81.

[4]Deniel N，Marion-Letellier R，Charlionet R，et al.Glutamine regulates the human epithelial intestinal HCT-8 cell proteome under apoptotic conditions[J].Mol Cell Proteomics，2007，6（10）：1671-1679.

[5]Johan D，Soderholm，Mary HP.Stress and the Gastrointestinal Tract ⅡStress and intestinal barrier function[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280（1）：7-13.

[6]Wang FJ，Wang SL，Zhao Y，et al.The influence of nutrition support routes on the intestinal mucosal epithelial cell cycle in burned rats[J].Zhonghua Shaoshang Zazhi，2002，18 （4）：203-206.

[7]Li JY，Yu Y，Hao J，et al.Determination of diamine oxdase activity in intestinal tissue and blood using spectrophotometry [J].Amino Acids&Biotic Resources，1996，18：28-30.

[8]Chen ZY，Wang SL，Yu B，et al.A comparison study between early enteral nutrition and parenteral nutrition in severe burn patients[J].Burns，2007，33（6）：708-712.

[9]Peng X，Yan H，You ZY，et al.Effects of enteral supplementation with glutamine granules on intestinal mucosal barrier function in severe burned patients[J].Burns，2004，30（2）：135-139.

[10]Kenji U，Toru T，Hiromi F，et al.The lower intestinal tract-specific induction ofheme oxygenase-1 by glutamine protectsagainst endotoxemic intestinal injury[J].Crit Care Med，2005，33（2）：381-390.

[11]Kana U，Toru T，Kazuyoshi I，et al.Prevention of hemorrhagic shockinduced intestinal tissue injury by glutamine via heme oxygenase-1 induction[J].Shock，2009，31（1）：40-49.

[12]Mary E，Evans，Dean P，et al.Glutamine inhibits cytokine-induced apoptosis in human colonic epithelial cells via the pyrimidine pathway[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，289（3）：388-396.

[13]Bryan C，F(xiàn)uchs BS，Barrie P，et al.Stressing out over survival： glutamine as an apoptotic modulator[J].Journal of Surgical Research，2006，131（1）：26-40.

[14]Marc G，Jeschke，Ullrich B，et al.Gut mucosal homeostasis and cellular mediators after severe thermal trauma and the effect of insulin-like growth factor-I in combination with insulin-like growth factor binding protein-3[J].Endocrinology，2007，148（1）：354-362.

[15]Lü SJ，Peng X，Zhang Y，et al.Effects of glutamine given through different avenues on intestine mucosal barrier function in burned rats[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2006，18（10）：619-622.