耿立英，王秀秀，王秋悅，潘素敏，朱文進(jìn)，張傳生，尹春光

(1河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島，066600;2濟(jì)寧學(xué)院)

畜禽品種的形成受到自然選擇和人工選擇共同作用，而種群在短期內(nèi)受到特異高強(qiáng)度正選擇作用，導(dǎo)致其基因組發(fā)生選擇性清掃現(xiàn)象，使某些優(yōu)勢(shì)基因可在種群中相對(duì)較快地?cái)U(kuò)散，進(jìn)而引起種群分化，形成生產(chǎn)性能和生產(chǎn)方向不同的品種或品系。因此，鑒定分析不同品種間特異的選擇性清除基因、標(biāo)記［1，2］，可為揭示不同品種的表型差異的分子機(jī)理提供線索。

近期，Carl-Johan Rubin等［3］采用重測(cè)序技術(shù)在雞基因組中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)選擇性清除(selective sweep)區(qū)域，其中就包括SH3RF2基因(SH3 domain containing ring finger 2)的插入/缺失位點(diǎn)。研究證實(shí)，SH3RF2基因在雞的大腦和肌肉中表達(dá)，其插入/缺失突變是與體重相關(guān)的原因突變，固定于肉雞的高長(zhǎng)系中(HW)，而在低長(zhǎng)系中(LW)和商品肉雞中(Broiler)以較低的頻率存在;還發(fā)現(xiàn)，該缺失與肉雞的生長(zhǎng)與體重存在的密切的正相關(guān)。趙妤娟等［4］對(duì)SH3RF2基因的插入/缺失突變?cè)?5個(gè)中國(guó)地方雞種的頻率分布進(jìn)行了研究，結(jié)果所檢測(cè)地方雞種均是非缺失的純合子，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)缺失等位基因。除此之外，對(duì)SH3RF2基因其他信息尚缺乏深入了解。

雞是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和模式生物，目前其全基因組測(cè)序工作的已經(jīng)完成。在雞后基因組時(shí)代，利用生物信息技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行解讀和研究已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，也已經(jīng)取得諸多重要的研究成果［5，6］。這對(duì)雞的SH3RF2生物信息分析提供了值得借鑒的方法和思路。因此，筆者主要運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)雞SH3RF2基因的進(jìn)化關(guān)系［7］、調(diào)控元件以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，以期為下一步研究該基因功能及其插入/缺失影響肉雞生長(zhǎng)和體質(zhì)量的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 不同物種間SH3RF2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)中檢索已發(fā)表的所有動(dòng)物SH3RF2基因的蛋白質(zhì)序列及cDNA序列，將獲得的不同動(dòng)物SH3RF2蛋白質(zhì)序列以FASTA格式保存為文本文件，所獲得的蛋白質(zhì)及cDNA序列用于下一步分析。利用程序DNAMAN6．0．3．48和MEGA4對(duì)不同動(dòng)物SH3RF2的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)鄰近歸并法(Neighbor-Joining)構(gòu)建種間系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1．2 雞SH3RF2基因MicroRNA靶標(biāo)及啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)

網(wǎng)站和工具軟件:由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)下載雞SH3RF2基因的mRNA數(shù)據(jù)信息;利用NCBI/Blast軟件進(jìn)行序列分析、同源性比對(duì)確定雞SH3RF2基因的3'UTR區(qū)序列;利用miRanda(1．0)軟件，裝載雞microRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)與CDS區(qū)序列和3'UTR區(qū)序列，在默認(rèn)參數(shù)條件下，預(yù)測(cè)microRNA靶標(biāo)，進(jìn)而選出與“種子”序列嚴(yán)格堿基互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)作為候選microRNA靶標(biāo)。

將雞 SH3RF2基因上游2 000 bp序列提交網(wǎng)站，http://www．fruitfly．org/seq_tools/promoter．html，http://www-bimas．cit．nih．gov/cgi-bin/molbio/proscan預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)雞 SH3RF2 基因的啟動(dòng)子序列［8］。

1．3 雞SH3RF2基因表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)相關(guān)預(yù)測(cè)

利用Protparam工具(http://www．expasy．org/tools/protparam．html)預(yù)測(cè)蛋白的基本理化性質(zhì)。利用ProtScale(http://expasy．org/tools/protscale．html)進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)。

將雞SH3RF2的蛋白質(zhì)序列提交到倫敦大學(xué)學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)系生物信息學(xué)部PSIPRED網(wǎng)站(http://bioinf．cs．ucl．a(chǎn)c．uk/psipred/)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

利用基于同源建模的分析工具 SWISS-MODEL(http://www．expasy．ch/swissmod/SWISS-MODEL．html)進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同物種SH3RF2同源性比較及進(jìn)化分析

本次研究共獲得9種動(dòng)物SH3RF2基因的編碼蛋白質(zhì)序列及cDNA序列，其物種、序列號(hào)等信息見(jiàn)表1。

表1 9種動(dòng)物SH3RF2基因和cDNA序列

根據(jù)獲得9種動(dòng)物SH3RF2基因的編碼蛋白質(zhì)序列構(gòu)建無(wú)根(Un-rooted)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖1)?？梢?jiàn):(1)9個(gè)動(dòng)物種可以明顯的分為A，B兩大類。A大類包括人、黑猩猩、獼猴、牛、犬、小鼠、褐家鼠等哺乳動(dòng)物，B大類只包括雞和珍珠鳥(niǎo)2個(gè)動(dòng)物種;(2)A大類的哺乳動(dòng)物間關(guān)系緊密，其中人、黑猩猩和獼猴，牛和犬，小鼠和褐家鼠等哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系均非常接近。B大類的雞和珍珠鳥(niǎo)屬于鳥(niǎo)類，它們與其它哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2．2 雞SH3RF2基因MicroRNA靶標(biāo)及啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析

本次研究預(yù)測(cè)到的雞在SH3RF2基因的CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)48個(gè)候選MicroRNA靶標(biāo)，在3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)10個(gè)候選MicroRNA靶標(biāo)(表2)。上述microRNA的“Seed”序列與CDS區(qū)和3'UTR區(qū)靶序列均嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)。

2．3 雞SH3RF2基因的啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析

本次研究利用在線工具預(yù)測(cè)雞SH3RF2基因上游2 000 bp序列可能的啟動(dòng)子，共發(fā)現(xiàn)2個(gè)，分別在120～170和1 724～1 774。

2．4 雞SH3RF2基因表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析

本次研究預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的分子量為69 248．4，分子式為C3041H4939N9150O893S20，理論等電點(diǎn)為10．15，含有20種基本氨基酸，其中含量最高的是Leu(占組成該蛋白的氨基酸總數(shù)的12．4%)，Ser(占氨基酸總數(shù)的11．6%)和Pro(占氨基酸總數(shù)的11．3%)，含量最低的是Trp(占氨基酸總數(shù)的0．6%)和Met(占氨基酸總數(shù)的0．9%);含有帶負(fù)電荷的殘基(Asp，Glu)44個(gè)，帶正電荷殘基(Arg，Lys)80個(gè)，其水溶液在280 nm處的消光系數(shù)約37 775。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(instability index，II)為62．99，不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為83．68。

用ProtScale程序預(yù)測(cè)雞SH3RF2蛋白質(zhì)疏水性分析最大值為2．722，最小值為－3．167，其疏水性平均值(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為 －0．343。

圖1 9個(gè)動(dòng)物種SH3RF2蛋白的無(wú)根系統(tǒng)分化樹(shù)

表2 SH3RF2基因的CDS區(qū)域和3'UTR microRNA預(yù)測(cè)及其位置

2．5 空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL對(duì)雞SH3RF2蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，只有部分殘基序列空間結(jié)構(gòu)可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到匹配的模板，預(yù)測(cè)到的空間結(jié)構(gòu)如圖2所示。其中第6～56位氨基酸殘基與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有模板匹配度為35．185%;第126～180位氨基酸殘基匹配度為78．182%;第188～249位氨基酸殘基匹配度為43．548%;第124～242位氨基酸殘基匹配度為24．675%;第405～461位氨基酸殘基匹配度為7．018%。

圖2 氨基酸殘基序列的空間結(jié)構(gòu)

3 討論與結(jié)論

首先，通過(guò)對(duì)9種不同物種SH3RF2蛋白同源性比較及進(jìn)化分析，構(gòu)建了無(wú)根系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。9個(gè)動(dòng)物種中A大類的哺乳動(dòng)物間關(guān)系緊密，其中人、黑猩猩和獼猴，牛和犬，小鼠和褐家鼠等哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系均非常接近。B大類的雞和珍珠鳥(niǎo)屬于鳥(niǎo)類，它們與其它哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能是因?yàn)殡uSH3RF2基因插入/缺失位點(diǎn)與肉雞生長(zhǎng)和體重密切相關(guān)，可以作為分子育種標(biāo)記應(yīng)用于中國(guó)肉雞的遺傳改良中，而在其它哺乳動(dòng)物中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)導(dǎo)，所以推測(cè)可能在雞的馴化過(guò)程中受到了較多的人為選擇作用而導(dǎo)致與其它哺乳動(dòng)物關(guān)系較遠(yuǎn)。

其次，通過(guò)網(wǎng)站和miRanda(1．0)等軟件對(duì)SH3RF2基因CDS區(qū)和3'UTR區(qū)域順式調(diào)控元件MicroRNA靶標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，分別預(yù)測(cè)到48個(gè)和10個(gè)候選靶標(biāo)。MicroRNA是一種內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，可通過(guò)與mRNA3'非編碼區(qū)的結(jié)合，抑制蛋白合成，在翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。這些蛋白表達(dá)水平的變化可引起生物的表型變異。上述調(diào)控機(jī)制對(duì)于禽類3'UTR區(qū)域SNP的功能研究具有重要意義［9］。目前已鑒定的雞microRNA近150種，這些miRNA的功能主要是調(diào)節(jié)與雞胚生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程有關(guān)的基因的表達(dá)。研究人員推測(cè)，雞中三分之一的基因都受到miRNA的調(diào)控［10～13］。Lancman等［14］證實(shí)，lin-4，let-7等可調(diào)控lin-41的表達(dá)在雞胚肢芽的發(fā)育中發(fā)揮作用。目前，所預(yù)測(cè)到這些MicroRNA是否可以調(diào)控SH3RF2表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。

另外，利用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的分析網(wǎng)站對(duì)雞SH3RF2基因上游2 000 bp序列進(jìn)行了啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)。分別在120～170 bp 1 466～1 716 bp處發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列。兩種方法所得的序列位置不同，這可能是由于數(shù)據(jù)庫(kù)還不是很完善，但是通過(guò)網(wǎng)上搜索和查閱文獻(xiàn)沒(méi)有能夠找到一個(gè)更好、更權(quán)威的預(yù)測(cè)方法，這可能需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)等其它方法進(jìn)行進(jìn)一步研究，來(lái)最終確定該基因的啟動(dòng)子序列。

最后，為了更好、更全面的了解這個(gè)基因，筆者又進(jìn)一步利用生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其蛋白理化性質(zhì)和一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，模擬了其二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)。由得到的空間結(jié)構(gòu)圖更加驗(yàn)證了本次研究預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的正確性，但是如果需要了解其精確的空間結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步通過(guò)X射線衍射實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行核磁共振等方法來(lái)確定。

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