史秋梅，張艷英，高桂生，高光平，程淑琴，裴玉欣

(1河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600，2河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系)

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，食品安全已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點(diǎn)。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因［1～4］，在人類的各種畜產(chǎn)品食用中，細(xì)菌性污染、中毒最為常見(jiàn)，而由大腸桿菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。大腸桿菌對(duì)人類的感染主要取決于其血清型和食用者的身體狀況。

許多血清型的大腸桿菌如出血性大腸桿菌，可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生腹瀉等食源性疾病及其他癥狀［5～7］。腸產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌(STEC)的致病性基因stx1與stx2分別編碼1型與2型志賀氏毒素，能引起一系列人類疾病，包括水樣腹瀉、出血性腸炎、血小板減少性紫癜、溶血性尿毒綜合征［8，9］。筆者通過(guò)對(duì)河北省的幾個(gè)大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市隨機(jī)抽檢的肉類食品采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法對(duì)抽樣的肉類食品進(jìn)行大腸桿菌的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)檢出的大腸桿菌進(jìn)行PCR復(fù)核性鑒定，并通過(guò)擴(kuò)增stx1與stx2基因，檢測(cè)STEC在食品中污染狀況，以控制食品中大腸桿菌的污染，防止污染食品進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng)，為確保市場(chǎng)上食品的安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣品來(lái)源 2010年7～9月從河北省的張家口、承德、廊坊、邯鄲、石家莊、保定、秦皇島市等市縣超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)無(wú)菌采集的肉、蛋類等，共計(jì)105份。

1．1．2 培養(yǎng)基及試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR－VP培養(yǎng)基、Korser氏枸椽酸鹽肉湯、Butter－field氏磷酸鹽緩沖稀釋液、革蘭染色液、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑、甲基紅指示劑、Voges－proskauer(V－P)試劑按文獻(xiàn)［10］制備。大腸桿菌STEC陽(yáng)性對(duì)照菌株EK274(stx1，stx2陽(yáng)性)購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由本實(shí)驗(yàn)室保存。瓊脂粉(天津市英博生化試劑有限公司)，樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京賽百盛有限公司);Maker(2000 plus)(購(gòu)自東盛生物有限公司)，PCR擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司合成。

1．1．3 主要設(shè)備 K－3401半自動(dòng)微生物鑒定儀(濟(jì)南大欣醫(yī)療器械科技有限公司)、PCR擴(kuò)增儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY－103B，上海智城分析儀器制造有限公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO－BEST200E，美國(guó)西盟)、電泳儀等。

1．2 方法

1．2．1 樣品制備 按照GB/T4789．4－2010方法以無(wú)菌操作稱取樣品25 g，放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8 000 r/min均質(zhì)1～2 min，制成1∶10樣品勻漿液。

1．2．2 分離和篩選

①每個(gè)樣品稀釋液分別接種到月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1 mL。種管置于36℃培養(yǎng)48 h，觀察試管的產(chǎn)氣情況，檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸桿菌陰性(未檢出);如有產(chǎn)氣者，記錄LST產(chǎn)氣情況，則進(jìn)一步做證實(shí)試驗(yàn)。

②用接種環(huán)將所有48 h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30 min內(nèi)放入帶蓋44．5℃水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h，記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板36℃培養(yǎng)24 h。檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落;如無(wú)典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上36℃培養(yǎng)18～24 h。

1．2．3 生化鑒定 將斜面培養(yǎng)物接種到下列培養(yǎng)基中或試劑中進(jìn)行生化試驗(yàn)。

色氨酸肉湯試驗(yàn):在36℃培養(yǎng)24 h后，加Kovacs氏試劑0．2～0．3 mL，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。MR－VP試驗(yàn):在36℃培養(yǎng)48 h，以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1～13 mL于100 mL管中，加50 g/L萘酚－乙醇溶液0．6 mL，質(zhì)量濃度為400 g/L KOH溶液0．2 mL和少許肌酸，振搖試管后靜置2 h，如出現(xiàn)紅色，為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR－VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48 h后，滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。Koser氏枸椽酸鹽試驗(yàn):于36℃培養(yǎng)96 h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。參照GB/T4789．4－2010方法，典型大腸桿菌與非典型大腸桿菌的生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 典型大腸桿菌與非典型大腸桿菌的生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1．2．4 PCR 鑒定

①大腸桿菌DNA提取 將分離到的19株大腸桿菌編號(hào)后無(wú)菌操作，接種到LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，180 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h。每株菌分別取1．0 mL LB營(yíng)養(yǎng)肉湯大腸桿菌菌液加入1．5 mL滅菌的離心管中，13 000 r/min離心30 s，收集菌體。將菌體懸浮于0．5 mL TE緩沖液中，按試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，取提取產(chǎn)物2 μL進(jìn)行電泳并記錄電泳圖譜。

②PCR擴(kuò)增大腸桿菌16S rRNA 按照Fermentas公司PCR試劑盒的使用說(shuō)明書，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增16S rRNA基因序列引物:正向引物5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′;反向引物 5′－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′，擴(kuò)增片段大小為 1 540 bp。

擴(kuò)增反應(yīng)為 25 μL 體系，其中 Dream TapTM Green PCR Master Mix 12．5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0．5 μL，模板(基因組 DNA)2 μL，Nuclease－Free Water 9．5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸10 min，循環(huán)擴(kuò)增30次。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

③PCR擴(kuò)增大腸桿菌stx基因 用細(xì)菌基因組DNA為模板，引物為:

stx2 上游引物 5′－GGCACTGTCTGAAACTGCTCC－3′

下游引物 5′－TCGCCAGTTATCTGACATTCTG－3′，擴(kuò)增片段大小為 255 bp。

stx1 上游引物 5′－CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC－3′

下游引物 5′－AATGCCACGCTTCCCAGAATTG－3′，擴(kuò)增片段大小為 244 bp。

PCR 擴(kuò)增體系為2 × Taq MasterMix 12．5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0．5 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水加至總體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件均為94℃ 10 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 10 min，33個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同食品種類大腸桿菌檢測(cè)

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，食品中大腸桿菌的總檢出率為18．1%(19/105)。其中生豬肉的大腸桿菌檢出陽(yáng)性率為23．8%(5/21)，生雞肉及其內(nèi)臟的大腸桿菌陽(yáng)性率為35．3%(12/34)，生雞蛋的大腸桿菌陽(yáng)性率為16．7%(2/12);生羊肉、生牛肉、生鴨蛋、生蝦都沒(méi)有檢出大腸桿菌(表2)。

2．2 不同地區(qū)大腸桿菌檢測(cè)

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，秦皇島市昌黎縣和石家莊市藁城縣的生豬肉，秦皇島市昌黎縣的生雞肉，石家莊市的辛集市的生雞蛋均有大腸桿菌存在(表3)。

表2 不同食品種類大腸桿菌檢出率

表3 不同地區(qū)食品中大腸桿菌檢出報(bào)告

2．3 大腸桿菌基因組DNA的提取

按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書所述方法進(jìn)行了上述19株食品源菌株基因組DNA的提取，得到了基因組DNA的條帶(圖1)，表明19株食品源菌株均成功提取到了其基因組DNA。

2．4 大腸桿菌PCR擴(kuò)增

根據(jù)大腸桿菌16S rRNA基因序列的特異性引物，采用PCR方法，以大腸桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增到了大小約1 540 bp的特異性條帶(圖2)，其大小與預(yù)期結(jié)果一致，19株食品源大腸桿菌均成功擴(kuò)增并檢測(cè)到大腸桿菌16S rRNA基因，與生化鑒定得到的結(jié)果一致。

圖1 部分菌株基因組DNA

圖2 PCR擴(kuò)增16S rRNA

2．5 腸產(chǎn)志賀樣毒素STEC的檢測(cè)

根據(jù)腸產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌STEC的stx1和stx2基因序列特異性引物，以大腸桿菌基因組DNA為模板，采用PCR方法，對(duì)19株大腸桿菌進(jìn)行stx1和stx2基因的檢測(cè)，分別擴(kuò)增得到了大小約255，244 bp的特異性條帶(圖3)，其大小與預(yù)期結(jié)果基本一致，表明成功擴(kuò)增并檢測(cè)到大腸桿菌stx1和stx2基因。檢出的2株腸產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌分別編號(hào)為E1和E2。E1為stx2(255 bp)陽(yáng)性，E2為stx1(244 bp)和stx2(255 bp)陽(yáng)性，均分離自生雞肉樣品。

圖3 PCR擴(kuò)增stx1和stx2

3 討 論

周建平［11］對(duì)從襄樊市的幾個(gè)大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽檢的60個(gè)樣品中，生雞肉大腸桿菌檢出率為30%，生豬肉50%，生牛肉20%，熟肉類20%。王想霞等［12］在濮陽(yáng)縣及市城區(qū)集貿(mào)市場(chǎng)、超市和餐飲店采集生肉(豬、雞、羊、牛肉)、散裝熟肉、生食蔬菜、生牛奶等4類食品共計(jì)261份，檢出了3種致病菌27株，其中O157:H7大腸桿菌7株。生肉類、熟肉類、生食蔬菜中大腸桿菌檢出率分別為2．5%，1．4%，7．3%。在可生食蔬菜中(蔥中檢出3份，香菜中檢出1份)檢出率達(dá)7．3%，這類生食蔬菜(尤其是香菜)大部分為直接入口食品，如果在食用過(guò)程中清洗不徹底，極易引起O157:H7的暴發(fā)與流行。實(shí)驗(yàn)還顯示，O157:H7夏季檢出率明顯高于秋季和冬季。馬國(guó)柱等［13］于2002年對(duì)陜西省食品中食源性致病菌進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，在5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集6類468份食品樣本，按常規(guī)方法分離鑒定E．coli O157:H7。共分離到E．coli O157:H7 5株，從生奶中檢出3株，生、熟牛肉中也各檢出1株。其中，從生牛奶中檢出具有stx2，hly，eae毒力基因1株，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠致死。只帥等［14］于2006～2009年采自陜西省西安市及楊凌示范區(qū)各大超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)全雞、牛肉、豬肉、羊肉和涼拌菜樣品357份，共分離出大腸桿菌748株，樣品大腸桿菌總陽(yáng)性率89%(319/357)，其中雞肉、牛肉、豬肉、羊肉、涼拌菜的大腸桿菌細(xì)菌數(shù)與陽(yáng)性樣品數(shù)分別為:375株，87%(149/171);67株，84%(32/38);61株，88%(30/34);62 株，91%(30/33);183株，96%(78/81)。并從豬肉及羊肉源樣品中分離到腸產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌2株。

本次試驗(yàn)按GB/T4789．4－2010方法分離培養(yǎng)細(xì)菌，結(jié)合生化試驗(yàn)和K－3401半自動(dòng)微生物鑒定儀，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法對(duì)抽樣的肉類食品進(jìn)行大腸桿菌的檢測(cè)并進(jìn)行PCR復(fù)核鑒定。2010年從河北省內(nèi)不同地區(qū)抽查的105份肉樣品中，生豬肉、生雞肉、生雞蛋的大腸桿菌陽(yáng)性率分別為23．8%，35．3%，16．7%，生羊肉、生牛肉、生鴨蛋、生蝦中沒(méi)有檢出大腸桿菌。從藁城縣和昌黎縣的生豬肉中分別檢測(cè)出了1株和4株大腸桿菌，而在其他地區(qū)的食品樣品中均未檢出大腸桿菌，可能是由于肉品保存不當(dāng)及衛(wèi)生狀況有關(guān)。秦皇島市昌黎縣是一個(gè)養(yǎng)殖密集區(qū)，飼養(yǎng)品種較多，從這次檢測(cè)抽查的生雞肉樣品中檢測(cè)到12株大腸桿菌，從石家莊市的辛集市的雞蛋中檢測(cè)出2株。與上述其他地區(qū)大腸桿菌檢出率相比較有一定差異，可能與夏季采樣的樣品數(shù)量較多、夏季溫度高有利于該菌的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。由STEC引起的病案中有85%是通過(guò)食物而污染人體的［15］。本次試驗(yàn)還從19株大腸桿菌中共檢測(cè)到2株STEC，檢出率10．52%，低于丁紅雷等［16］從326 份鮮奶中檢出 STEC 的結(jié)果(14．42%)，高于 Altalhi等［17］的檢出結(jié)果(9．1%)，說(shuō)明檢出率與樣品種類、樣品采樣季節(jié)有一定差異。

通過(guò)本次試驗(yàn)，建議在食品加工制作及烹調(diào)過(guò)程中，對(duì)生肉、海產(chǎn)品要注意煮熟煮透，同時(shí)應(yīng)防止交叉污染;其次，要養(yǎng)成良好的衛(wèi)生飲食習(xí)慣，不要吃生腌的海產(chǎn)品。因?yàn)樯绲暮Ｎr、生蠔、螃蟹、蚶等食品，其鹽腌過(guò)程很難殺滅所有的致病菌和寄生蟲，很容易引發(fā)細(xì)菌性食物中毒的發(fā)生和其他食源性疾病的發(fā)生。再次，政府部門應(yīng)加強(qiáng)經(jīng)費(fèi)投入，加強(qiáng)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)和食源性致病菌的監(jiān)測(cè)，以便能及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，適時(shí)提出預(yù)警和采取相應(yīng)的預(yù)防與控制措施，防止食源性疾病的發(fā)生。

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