陳麗鳳，張香齋，王秋悅，劉朋朋，王思偉，鄒亞學(xué)

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600)

梨形蟲病是一類經(jīng)硬蜱傳播，由梨形蟲綱巴貝斯科或泰勒科原蟲引起的血液原蟲病的總稱。迄今為止，全世界已記載的各種哺乳動(dòng)物的巴貝斯蟲有67種，泰勒蟲有13種［1］。羊梨形蟲病是世界性分布的嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的一類重要疾病。該病主要呈地方性流行，危害嚴(yán)重，可引起羔羊和外地引進(jìn)羊大量死亡，使慢性發(fā)病的羊發(fā)育遲緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，從而給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2，3］。筆者對采自河北省石家莊地區(qū)新樂市某羊場的羊進(jìn)行梨形蟲檢測，以便了解和掌握該地區(qū)羊自然感染梨形蟲情況，為預(yù)防該病提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物 31只小尾寒羊，引自河北省新樂市某羊場。

1．1．2 主要試劑 PCR相關(guān)試劑，2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);PCR所用引物，GoldViewTM核酸染料，DM2000，血液基因組提取試劑盒，由北京賽百盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供與合成。

1．1．3 儀器設(shè)備 高壓滅菌器(YXQ－LS－18SI，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，超純水純化系統(tǒng)(Milli－Q Gradient，法國Millproe)，電子分析天平(YP601N，上海天平廠)，超級(jí)恒溫水浴箱(601型，金壇市醫(yī)療儀器廠)，高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL－16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)，可調(diào)微量移液器(0．5 ～10 μL，10 ～100 μL，100～1 000 μL，德國普蘭德)，PCR 儀(Mastercycler gradient，德國 Eppendorf公司)，微波爐(MC－2480EGR，青島海爾集團(tuán))，雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(DYY－6C型，北京六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO－BEST200E，美國SIM)。以上儀器設(shè)備均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2 方法

1．2．1 血樣采集 對新樂市小尾寒羊隨機(jī)進(jìn)行頸靜脈抽血，采取血樣31份，每份2 mL，分裝入抗凝離心管，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，保存待檢。

1．2．2 模板DNA制備 將采集的羊血液參照試劑盒說明書提取羊血液基因組DNA。

1．2．3 引物設(shè)計(jì) 羊梨形蟲PCR檢測引物名稱及序列見表1。

1．2．4 巢式PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各0．5 μL，模板各1．0 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL。離心混勻后選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 羊梨形蟲PCR檢測引物名稱及序列

1．2．5 反應(yīng)參數(shù)

①羊梨形蟲通用片段PCR反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火60℃，40 s;延伸72 ℃，1 min，30 個(gè)循環(huán);延伸72 ℃，7 min。

②尤氏泰勒蟲PCR反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火64℃，40 s;延伸72℃，40 s，30 個(gè)循環(huán);延伸72 ℃，7 min。

③呂氏泰勒蟲PCR反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火50℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 個(gè)循環(huán);延伸72 ℃，7 min。

④中華泰勒蟲PCR反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火62℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 個(gè)循環(huán);延伸72 ℃，7 min。

⑤羊巴貝斯蟲PCR反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火55℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 個(gè)循環(huán);延伸72 ℃，7 min。

1．2．6 PCR反應(yīng) 第一輪PCR:以DNA為模板，采用蟲種通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。第二輪PCR:以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，分別采用尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、羊巴貝斯蟲引物，對第一輪PCR擴(kuò)增的陽性樣本進(jìn)行擴(kuò)增。

1．2．7 電泳檢測 反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié) 果

本次試驗(yàn)共檢測樣本31份，其中樣本Y15，Y19，Y22，Y28擴(kuò)增出約800 bp特異性條帶(圖1，圖2)。將此4個(gè)樣本分別對尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、羊巴貝斯蟲進(jìn)行第二輪PCR檢測，僅呂氏泰勒蟲擴(kuò)增出了約500 bp特異性條帶(圖3)。

圖1 蟲體通用基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 蟲體通用基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 呂氏泰勒蟲基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

羊梨形蟲病是我國北方農(nóng)區(qū)、半農(nóng)牧區(qū)及半林半牧區(qū)綿羊、山羊的常發(fā)病之一。血清學(xué)調(diào)查顯示，從每年3月份血清抗體水平陽性率開始上升，到5月份達(dá)到最高值68．2%，到 10 月份達(dá)到最低值 36．4%［4］。據(jù)調(diào)查，綿羊羔羊發(fā)病率為60．81%，病死率為81．48%;山羊羔羊發(fā)病率為40%，病死率為85．71%，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的損失［5］。

目前，我國已報(bào)道的羊的梨形蟲有5個(gè)種，即呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種［6，7］。它們都能引起動(dòng)物貧血和黃疸等臨床癥狀，并且血涂片觀察時(shí)泰勒蟲之間以及巴貝斯蟲之間的形態(tài)非常相似，常呈混合感染狀態(tài)，不易進(jìn)行區(qū)別，這就給梨形蟲病的防控帶來了一定的困難。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在這一領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，解決了許多應(yīng)用經(jīng)典生物學(xué)技術(shù)難以證實(shí)或明確的問題，并為梨形蟲病的防治提供了很多新的理論和手段，取得了巨大的成果。國際上，對梨形蟲病的診斷方法已從血涂片檢查、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接熒光抗體，發(fā)展到了DNA探針、PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等更快速、準(zhǔn)確的檢測方法。其中PCR技術(shù)被認(rèn)為是當(dāng)前診斷梨形蟲最敏感的方法之一［8，9］。本次試驗(yàn)根據(jù)18S rRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物對河北省新樂市的羊梨形蟲進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，31只羊有4只感染梨形蟲，且均為呂氏泰勒蟲，說明河北省新樂市羊梨形蟲種類主要為呂氏泰勒蟲，自然感染率較高(12．9%)，對梨形蟲病的潛在威脅不容忽視。

［1］蔣金書．動(dòng)物原蟲病學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000．

［2］王長吉．中國動(dòng)物疫病志［M］．北京:科學(xué)出版社，1993．

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