孔繁軍，陳 強(qiáng)，周 亮，崔德華＊

（1．北京海淀醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京100080；2．寧波市北侖宗瑞醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；3．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 神經(jīng)科學(xué)研究所）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種發(fā)生于老人的最常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征則是在腦中形成大量的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及出現(xiàn)彌漫性腦萎縮［1］。其病因發(fā)病機(jī)制的研究1984年，Glenner and Wong從老年斑中純化和分離得到Aβ并解讀得到其蛋白序列［1］，才開始有了顯著的進(jìn)展。隨后的研究表明老年斑的主要成分是β－淀粉樣蛋白（β－amyloid peptide，Aβ），由β－淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）裂解產(chǎn)生，Aβ的寡聚體和纖維化是AD患者腦內(nèi)重要的病理改變，在凝聚形成Aβ纖維的過程中，具有過氧化損傷，引起炎癥反應(yīng)，損傷突觸功能等多種神經(jīng)毒性，對AD的病理進(jìn)程起關(guān)鍵作用［2］。本實(shí)驗(yàn)采用單體、寡聚體及纖維化Aβ?lián)p傷大鼠海馬CA1區(qū)來制備AD大鼠模型，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AD大鼠不同腦區(qū)細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 選取雄性Wistar大鼠64只，鼠齡3－4個(gè)月，體重200－250g，大鼠隨機(jī)分為Aβ組、生理鹽水組及假手術(shù)對照組，每組16只。

1．2 不同種類 Aβ制備［5］將 Aβ1－40溶于滅菌過的超純水，配成500μmol·L－1儲存液分裝，于－20℃凍存。寡聚體Aβ使用前于37℃孵育48h，纖維狀A(yù)β使用前于37℃孵育21d。不同類型Aβ使用AFM法觀察確認(rèn)寡聚體Aβ和纖維狀A(yù)β。單體Aβ1－40不在37℃孵育7d，凍結(jié)后馬上使用。采用核黃素標(biāo)記光度法測定Aβ凝聚度。

1．3 動物模型的制作 用10%水合氯醛腹腔注射（0．3－0．35ml／100g）麻醉大鼠。將頭部固定在立體定位儀上，頭背中部縱向切口，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選右側(cè)海馬為注射區(qū)，定位坐標(biāo)：前囟后3．0mm，中線右側(cè)2．0mm，硬膜下2．6 mm。鉆開顱骨，分離暴露硬腦膜，垂直進(jìn)針至靶點(diǎn)，緩慢注射5μl寡聚體 Aβ1－40（濃度為1μg／μl，預(yù)先37℃下孵育1w），注射時(shí)間為5min，留針5 min，保證溶液充分彌散，撤針，縫合切口，所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。假手術(shù)組切開硬腦膜后即縫合傷口。Aβ組、生理鹽水組及假手術(shù)對照組用生理鹽水按等量代替。

1．4 不同Aβ對海馬細(xì)胞凋亡 （1）制備單細(xì)胞懸液：術(shù)后7d各組取5只大鼠，處死動物，在冰盤上快速取新鮮海馬、額葉、顳葉約0．2g，0．1MPBS（pH7．4）洗滌，剪碎，0．3%胰蛋白酶3．0ml，37℃消化30min，在PBS中洗滌、吹打成單細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾，－20℃預(yù)冷的無水乙醇3ml中固定，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）細(xì)胞凋亡百分率測定［5］：細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個(gè)，加100μl RNAse 37℃水浴30min，加入PI染色液800μl混勻，4℃避光30 min，上機(jī)進(jìn)行FCM檢測，測定數(shù)據(jù)按FAC Scan所配置的ModFit軟件進(jìn)行分析，以細(xì)胞周期各時(shí)相以及AP區(qū)亞峰細(xì)胞百分率記錄數(shù)據(jù)。

1．5 采用核黃素標(biāo)記光度法測定Aβ凝聚方法 參照我們已發(fā)表JBC論文的方法測定Aβ凝聚［5］。

2 結(jié)果

2．1 不同的Aβ的β凝聚度

Aβ隨時(shí)間依賴性凝聚度增強(qiáng)。單體Aβ與寡聚體Aβ組間數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），并且纖維化Aβ與寡聚體Aβ組間數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），見圖1。

圖1 不同的Aβ的β凝聚度

2．2 不同的Aβ對海馬細(xì)胞凋亡的變化 對照組與單體Aβ組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；多聚體Aβ組與單體及纖維化Aβ、對照組數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），寡聚體Aβ組海馬含G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯升高，見圖2。

此結(jié)果說明單體Aβ沒有毒性，寡聚體Aβ對海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性最大，但是轉(zhuǎn)化成纖維化Aβ，則神經(jīng)毒性反而降低。

圖2 表示不同的Aβ對海馬細(xì)胞的毒性作用。mo－Aβ，單體Aβ；o－Aβ，寡聚體Aβ；f－Aβ，纖維化 Aβ，各組n＝5，＊＊P＜0．01。

2．3 不同的Aβ的β凝聚度和海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡之間的關(guān)系

為了闡明Aβ的β凝聚性對神經(jīng)細(xì)胞的毒性之間的關(guān)系，對單體Aβ，寡聚體Aβ及纖維化Aβ組的凝聚度和細(xì)胞毒性做了相關(guān)分析。結(jié)果顯示Aβ凝聚度與海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性無正相關(guān)，即并不是凝聚度越高毒性越大，反而纖維化Aβ毒性下降。此結(jié)果進(jìn)一步支持寡聚體Aβ在AD發(fā)生起關(guān)鍵作用。

3 討論

AD是一種導(dǎo)致老年性癡呆的常見疾病，其臨床特征主要為進(jìn)行性記憶減退、言語和行為障礙，AD的病因和發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。但目前認(rèn)為Aβ是AD老年斑的核心成分，被認(rèn)為是多種原因?qū)е翧D的共同通路［1］。我們采用經(jīng)體外孵育的凝聚狀態(tài)的Aβ1－40海馬CA1區(qū)立體定向注射建立AD動物模型，以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單側(cè)海馬CA1區(qū)注射后1周的Aβ組大鼠明顯表現(xiàn)出記憶獲得和記憶再現(xiàn)的損傷作用，形態(tài)學(xué)觀察證明在Aβ腦內(nèi)可引起神經(jīng)元的凋亡，說明Aβ海馬區(qū)注射Aβ1－40建立的模型比較符合AD的自然病理過程。

本實(shí)驗(yàn)采用FCM以碘化丙啶（PI）為特異性熒光探針標(biāo)記細(xì)胞，單參數(shù)分析細(xì)胞內(nèi)DNA相對含量，對Aβ1－40海馬CA1區(qū)損傷大鼠不同腦區(qū)腦組織所制作的單細(xì)胞懸液進(jìn)行凋亡百分率檢測，結(jié)果提示，Aβ組凋亡百分率明顯升高，與其它各組比較差異明顯，說明Aβ神經(jīng)毒性可致神經(jīng)細(xì)胞凋亡性改變。

脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶以模板依賴性方式催化用熒光素或同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸與DNA片段游離3－OH末端發(fā)生聚合反應(yīng)，用于標(biāo)記DNA鏈斷片，然后進(jìn)行或同位素檢測。TUNEL法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度較高［2］。

Aβ與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［3］，在培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中加入Aβ后神經(jīng)元出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡典型形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征［6］。在APP717轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ廣泛沉積，大量神經(jīng)元發(fā)生凋亡，同時(shí)伴有P53蛋白表達(dá)的增加［7］。將 Aβ1－40注射到成年小鼠腦內(nèi)，海馬可見到明顯細(xì)胞丟失，而在Caspase－3基因缺失小鼠，則細(xì)胞丟失不明顯［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果用FCM和TUNEL法證明在Aβ腦內(nèi)可引起神經(jīng)元的凋亡，支持細(xì)胞凋亡參與了AD發(fā)病的觀點(diǎn)。

AD發(fā)病機(jī)制中涉及細(xì)胞凋亡有關(guān)的多個(gè)環(huán)節(jié)［9］。老年斑的主要成分寡聚體Aβ激活Caspases，一組啟動和執(zhí)行凋亡的蛋白水解酶，導(dǎo)致細(xì)胞核和細(xì)胞骨架蛋白的裂解，其中Tau蛋白的降解是神經(jīng)纖維變性的關(guān)鍵［10］。Aβ的神經(jīng)毒性作用可直接或間接損傷線粒體膜而使膜電位下降，PT孔的開啟可以引發(fā)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要事件［11］，如線粒體內(nèi)Ca2＋的釋放及質(zhì)子的滲漏、細(xì)胞色素C的釋放、Caspases激活因子的釋放、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，Bcl－2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與等。不同信號的傳導(dǎo)最終集中到線粒體上來啟動或抑制這些事件及其效應(yīng)的產(chǎn)生［12］。

Aβ寡聚體比單體及纖維化Aβ毒性顯著增高，因此，防止Aβ寡聚體化可抑制凋亡蛋白的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可能對減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損害提供新的思路和策略。

［1］Cotman CW，Poon WW，Rissman RA，et al．The role of caspase cleavage of tau in Alzheimer disease neuropathology［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2005，64（2）：104．

［2］Wu CK，Thal L，Pizzo D，et al．Apoptotic signals within the basal forebrain cholinergic neurons in Alzheimer＇s disease［J］．Ecp Neurol，2005，195（2）：484．

［3］Yanker BA．Mechanisms of neuronal degeneration in Alzheimer’s disease［J］．Neuron，1996，16：921．

［4］Chui DH，Tanahashi H，Ozawa K，et al．Transgenic mice with Alzheimer presenilin 1mutations show accelerated neurodegeneration without amyloid plaque formation［J］．Nature Medicine，1999，5（5）：560．

［5］Yoshiike Y，Chui DH，Akagi T，et al．Specific compositions of amyloid－beta peptides as the determinant of toxic beta－aggregation［J］．J Biol Chem，2003，278（26）：23648．

［6］Alvarez AR，Godov JA，Mullendorff K，et al．Wnt－3aovercomes beta－amyloid toxicity in rat hippocampal neurons［J］．Exp Cell Res，2004，297（1）：186．

［7］Laferla FM，Hall CK，Ngo L，et al．Extra cellular deposition ofβamyloid upon P53－dependent neuronal cell death in transgenic mice［J］．J Clin Invest，1996，98（7）：1626．

［8］Takuma H，Tomiyama T，Kuida K，et al．Amyloid beta peptideinduced cerebral neuronal loss is mediated by caspase－3in vivo［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2004，63（3）：255．

［9］Clementi ME，Pezzotti M，Orsini F，et al．Alzheimer＇s amyloid beta－peptide（1－42）induces cell death in human neuroblastoma via bax／bcl－2ratio increase：An intriguing role for methionine 35［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，342（1）：206．

［10］Wirths O，Multhaup G，Bayer TA．A modified beta－amyloid hypothesis：intraneuronal accumulation of the beta－amyloid peptide－－the first step of a fatal cascade［J］．J Neurochem，2004，91（3）：513．

［11］Keil U，Bonert A，Marques CA，et al．Amyloid beta－induced changes in nitric oxide production and mitochondrial activity lead to apoptosis［J］．J Biol Chem，2004，279（48）：50310．

［12］Green DR，Reed JC．Mitochondria and apoptosis［J］．Science，1998，281：1309．