王作書，李曉華，明 月＊

（1．吉林省消防總隊醫(yī)院，吉林 長春130061；2．吉林大學第二醫(yī)院 眼科，吉林 長春130041）

人參皂甙Rb1（Ginsenoside Rb1）是由人參中提取三醇組皂甙，具有增強免疫功能、促進學習記憶、抗衰老、抗腫瘤、清除氧自由、改變碳水化合物和脂質代謝等多種生物學效應［1－3］；本室以往研究已證實 人 參 莖 葉 總 皂 甙 （Ginsenoside of Stems and Leaves，GSL）（含Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg2）和人參皂甙單體Rb2和Rg3有抑制RPE細胞增殖的作用，我們進一步觀察了Rb1對培養(yǎng)的人RPE細胞增生的影響。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑 培養(yǎng)的RPE細胞來源于孕26周流產胎兒人胚眼，主要試劑包括：改良的Eagle培養(yǎng)液（Delbecco，s modified Eagle，s medium DMEM培養(yǎng)液）（GIBCO），胎牛血清（FCS，GIBCO），溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍（MTT，北京華美生物工程公司），二甲基亞砜（DMSO，國產分析純），3H－TDR購自北京原子能研究所，放射強度為lmCi。人參皂甙Rb1由吉林大學基礎醫(yī)學院藥理研究室惠增，無色液體，實驗前用DMEM溶解配成不同濃度。

1．2 方法

1．2．1 RPE細胞的培養(yǎng) 人胚眼球在無菌條件下，沿扁平部剪開，剔除前部組織、玻璃體及視網膜感覺部，后節(jié)眼杯用PBS液漂洗后在解剖顯微鏡下分成4塊展平后，放入DMEM培養(yǎng)液中，顯微鏡下剝離RPE層，將得到的RPE置于0．25%胰蛋酶（trypsin）中消化30min，FCS終止消化，注吸法分離RPE，離心、清洗后接種于含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。RPE細胞為貼附型細胞，取第5代用于實驗。

1．2．2 藥物濃度與效應關系實驗 RPE細胞經酶消化后制成細胞密度2×104／ml細胞懸液，每孔2 ml接種于24孔塑料培養(yǎng)板，孵育24h后換為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，加入人參皂甙Rb1，使其終濃度為0、2、5、10、50、100、120、150、200和250μg／ml，每種濃度3孔，培養(yǎng)12h后，更換成不含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，trypsin消化制成細胞懸液，給藥組和對照組各取3孔臺盼藍染色計數，計算抑制率。細胞活力測定：取各樣本細胞懸液0．9ml加入1%臺盼藍0．1ml，混勻，血細胞計數板盲法計數，著色細胞為死細胞，以活細胞數占計數細胞的百分比反應細胞活力。

1．2．3 時間與藥物效應關系實驗 同上接種細胞，孵育24h后換液后加入Rb1使其終濃度為50μg／ml，對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)12、24、48、72、96和120h經trypsin消化后臺盼藍染色計數，計算增生抑制率。

1．2．4 MTT 比色法 取密度為4×104／mlRPE細胞懸液200μl接種于96孔板，孵育24h后棄液，加入不含血清含Rb1的培養(yǎng)液，Rb1終濃度分別為10、50、100、120 和 150μg／ml，對照組加 入 等 量DMEM培養(yǎng)液，每組3復孔。培養(yǎng)12h后用培養(yǎng)液漂洗細胞1次，加入5mg／ml MTT（Sigma）10μl和190μl DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)6h，棄液，每孔加入DMSO 100μl，振搖10min，用Bio－RAD550型酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長下讀取吸光值（A值），

進行t檢驗并計算生存率和EC50。

1．2．53H－TdR摻入法 步驟同1．2．4，Rb1濃度分別為50、100、120、150和200μg／ml，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，每組3復孔。培養(yǎng)24h后每孔加入1uCi3H－TdR，繼續(xù)培養(yǎng)12h，Trypsin消化制定細胞懸液，收集細胞于纖維濾膜上，洗滌，涼干后置入閃爍瓶中，加入二甲苯閃爍液，用液體閃爍計數儀測定每分鐘計數值（counts per minute，cpm），進行t檢驗并計算摻入抑制率。

2 結果

2．1 劑量－效應關系 RPE細胞數隨Rb1濃度增加而減少，Rb1在2、5、10、50、100、120、150、200、250μg／ml對細胞增生的抑制率依次為22．70%、36．49%、41．67%、49．43%、76．44%、85．34%、86．49%、85．92%和86．78%。

2．2 時間－效應關系 貼壁生長良好的RPE細胞在給藥后12h可見部分細胞脫落，與對照組相比Rb1組在給藥后12、24、48、72、96和120小時 RPE細胞 增 生 抑 制 率 分 別 為 18．77%、38．80%、58．89%、71．59%、77．69%和77．33%；于給藥后96 h內，其抑制效應隨時間而明顯增強，各組細胞活力均在90%以上。

2．3 Rb1對RPE細胞增殖的抑制作用 Rb1組A值明顯低于對照組（見表1），Rb1對人胚RPE細胞的EC50為44．55μg／ml。

表1 不同濃度Rb1作用下RPE的生存率

2．4 Rb1對RPE細胞DNA合成的抑制作用Rb1組cpm值隨藥物濃度增加而降低（見表2），DNA合成抑制率增加。

表2 人胚RPE細胞在Rb1作用下DNA合成抑制率

3 討論

增殖性玻璃體視網膜病變（Proliferative vitreoretinopathy，PVR）被認為是眼內炎癥、孔源性視網膜脫離（Retinal Detachment，RD）、外傷、眼內手術后的損傷修復過程，是由多種細胞、生長因子、細胞因子、膠原和細胞外基質相互作用的病理過程。病理學研究表明視網膜色素上皮細胞（RPE）是發(fā)生PVR時最重要的細胞，RPE在病理情況下可移行至玻璃體內并在玻璃體內散布、增生、合成膠原及其它細胞基質，并具有成纖維細胞樣作用［4］。PVR是引起視力障礙甚至失明的嚴重眼病之一，是導致RD手術失敗的最常見原因。玻璃體手術雖可有效治療PVR，但術后仍有一些病人復發(fā)，最終導致視力喪失，探討PVR的藥物治療逐漸成為國內外眼科工作者的研究熱點。本實驗通過細胞計數法、MTT比色法和3H－TdR摻入法探討Rb1對RPE細胞增生的影響，結果發(fā)現Rb1對培養(yǎng)的人胚RPE細胞增生具有抑制作用，在一定時間（96h）和劑量范圍內（2μg／ml至200μg／ml）存在時間依賴和劑量依賴關系。我們還發(fā)現貼壁生長良好的RPE細胞在給藥后12小時即可見部分細胞脫落，貼附是貼附型細胞生長增殖的條件之一，通常細胞表面有由細胞分泌的糖蛋白膜，即細胞外衣，它對細胞運動尤其是貼附于支持物生長有重要作用［5］。細胞外衣的性質與細胞物質膜電位、酸堿失衡有關，改變細胞外衣的性質可使細胞由支持物上脫落下來。有研究表明RPE細胞中游離鈣的濃度調節(jié)細胞吞噬功能狀態(tài)、細胞增殖及細胞與基底膜的粘附力［6］；同時鈣離子還是細胞收縮、吞噬、物質轉運與代謝及酶活性調節(jié)的基礎調控者［7］。大量實驗證實人參皂甙單體Rb1具有抑制細胞外鈣內流降低膜電位［2，8，9］。由此推測Rb1可能通過阻滯鈣通道改變細胞內鈣濃度引起細胞粘附力、增殖力下降，同時干擾細胞內酶活性和物質代謝；同時通過抑制鈣和鈉離子內流改變膜電位抑制RPE過度增殖。由于正?；罴毎€粒體內活性脫氫酶可將MTT還原為紫色的甲潛（formazan），且細胞的存活數與其產生的甲潛的A值之間存在線性關系。MTT比色法發(fā)現給藥組細胞甲潛產生量少于對照組，A值明顯低于對照組，細胞生存率隨藥物濃度增加而下降，進一步證實Rb1可干擾細胞代謝。本實驗通過3H－TdR摻入實驗證實Rb1可抑制RPE細胞DNA合成，其抑制作用在一定濃度范圍內藥物隨濃度的增加而增強。

Rb1可通過抑制DNA合成，并可能通過抑制鈣和鈉的內流、改變膜電位、干擾細胞代謝、改變細胞外衣的性質而抑制RPE細胞增殖。Rb1作用與人參三醇組皂甙相似，Rb1能否抑制RNA、膠原合成及對PVR動物的治療作用尚在研究中，Rb1有望成為治療PVR的有效藥物。

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