曾 鑫，王永星，姚 武，付曉麗，郝長付#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001

轉(zhuǎn)分化是指一種分化完全的細(xì)胞由于某些因素作用，丟失其原有表型特點而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋图?xì)胞的一種特定的生理或病理過程[1]。在矽肺發(fā)生過程中，SiO2可刺激肺泡巨噬細(xì)胞分泌各類活性介質(zhì)，尤其是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及膠原蛋白(COL)表達(dá)上調(diào)，凋亡受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原合成，最終引起肺纖維化[2-3]。以往在肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究中多采用細(xì)胞間接共培養(yǎng)法即將巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)，再用巨噬細(xì)胞上清刺激成纖維細(xì)胞。細(xì)胞直接共培養(yǎng)方法則是借助Trans-well小體將兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。該研究中作者分離了SD大鼠肺巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，采用ThinCertTM建立直接共培養(yǎng)模型，加入不同質(zhì)量濃度的SiO2，觀察肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程，確定直接共培養(yǎng)模型的價值，為進(jìn)一步研究肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級成年雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2010-0002。游離SiO2粉塵標(biāo)準(zhǔn)品(粒徑為1～5 μm，美國Sigma公司)，180℃恒溫下烘烤4 h，用DMEM培養(yǎng)液(索萊寶公司)制成粉塵懸液(1 g/L)，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠肺成纖維細(xì)胞的提取和純化 參照嚴(yán)玉蘭等[4]方法。

1.3 大鼠肺巨噬細(xì)胞的提取、純化和活性鑒定 參照丁煥然等[5]的方法提取大鼠肺巨噬細(xì)胞，然后加入不同質(zhì)量濃度的SiO2粉塵懸液處理，采用MTT法檢測巨噬細(xì)胞活性，確定后續(xù)實驗中SiO2的質(zhì)量濃度。

1.4 ThinCertTM共培養(yǎng) 取5～8代的成纖維細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長融合至80% ～90%時，在ThinCertTM內(nèi)接種約1×106個巨噬細(xì)胞，懸掛于6孔板孔內(nèi)。

1.5 實驗分組 實驗分4組:空白組加入無SiO2粉塵的培養(yǎng)基;SiO2低、中、高劑量組在ThinCertTM內(nèi)加入終質(zhì)量濃度分別為25、50和100 mg/L的SiO2粉塵懸液，每孔2 mL，放入培養(yǎng)箱中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。

1.6 大鼠肺成纖維細(xì)胞α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的檢測 采用real time-PCR。用Trizol法提取大鼠成纖維細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參GAPDH引物序列為上游5’-GGTGCTGAGTAT GTCGTGGAGT-3’，下 游 5’-CAGTCTTCTGAGTG GCAGTGAT-3’，產(chǎn)物292 bp;α-SMA引物序列上游5’-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3’，下游 5’-GGG AGCATCATCACCAGCAA-3’，產(chǎn)物 127 bp;COLⅠ引物序列，上游5’-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3’，下游 5’-GGGACCCTT AGGCCATTGTGTA-3’，產(chǎn)物 119 bp;COLⅢ引物上游 5’-TTTGGCACAG CAGTCCAATGTA-3’，下 游 5’-GACAGATCCCG AGTCGCAGA-3’，產(chǎn)物121 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。反應(yīng)體系20 μL:cDNA 模板 1 μL，Priemix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為:95℃10 min，95℃10 s，59℃(GAPDH)或58℃(α-SMA)或58℃(COLⅠ)或57℃(COLⅢ)30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品平行測定3 次，用 2－ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)量。

1.7 培養(yǎng)上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ蛋白的檢測 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。收集培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書操作，先用標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再求出待測樣品中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ質(zhì)量濃度。每個樣品平行測定6次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0處理數(shù)據(jù)。4組間肺成纖維細(xì)胞中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢmRNA的表達(dá)量和培養(yǎng)上清中上述3指標(biāo)質(zhì)量濃度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用 Dunnet’t檢驗，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組肺成纖維細(xì)胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的表達(dá)量 見表1。

表1 4組肺成纖維細(xì)胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ mRNA的表達(dá)量

2.2 4組培養(yǎng)上清中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢ質(zhì)量濃度的比較 見表2。

表2 4組培養(yǎng)上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ質(zhì)量濃度的比較 μg/L

3 討論

矽肺是塵肺病中危害最嚴(yán)重的一種，長期吸入SiO2粉塵導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞是矽肺發(fā)病重要的細(xì)胞基礎(chǔ)已為大量國內(nèi)外研究[2-3，6]所證實。粉塵吸入肺內(nèi)，最先受到損傷的是肺巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的致纖維化細(xì)胞因子作用于肺成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。而肺成纖維細(xì)胞在正常靜息狀態(tài)下不具有過度增殖和分泌能力，發(fā)生活化、功能改變是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的結(jié)果[7]。在肺纖維化發(fā)生時，COLⅠ、COLⅢ蛋白的變化成為反映細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分變化的主要指標(biāo)[8]。成纖維細(xì)胞α-SMA、COLⅠ、COLⅢ蛋白含量增加，提示成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是纖維化的標(biāo)志。

以往矽肺纖維化研究多采用間接共培養(yǎng)方法[9]，即從肺部分離巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用SiO2刺激巨噬細(xì)胞所得的培養(yǎng)上清液作用于肺成纖維細(xì)胞，這種方法在時間與空間上都與體內(nèi)存在較大的差異。ThinCertTM共培養(yǎng)模型即直接用SiO2刺激ThinCertTM內(nèi)的巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌大量細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素、干擾素、TGF-B1、腫瘤壞死因子-α等)，同步作用于成纖維細(xì)胞，這種模型更好地模擬了體內(nèi)環(huán)境。該研究結(jié)果顯示，ThinCertTM共培養(yǎng)方式下，SiO2各處理組 α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA和蛋白的表達(dá)量均高于對照組，且隨SiO2質(zhì)量濃度的增加而升高，表明ThinCertTM共培養(yǎng)方式成功模擬了肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程，用 ThinCertTM共培養(yǎng)方式建立的體外細(xì)胞模型在肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究中有應(yīng)用價值。

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