黨裔武，容敏華，陳 罡△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，南寧530021）

肝癌石蠟包埋組織miRNA提取方法的優(yōu)化＊

黨裔武1，容敏華2，陳 罡1△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，南寧530021）

目的改進(jìn)并優(yōu)化從肝癌（HCC）甲醛固定石蠟包埋組織（FFPE）提取并檢測(cè)微小RNA（miRNA）的方法。方法使用miRNeasy FFPE試劑盒探討提取HCC石蠟組織miRNA最佳切片厚度及蛋白酶K作用時(shí)間。實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及RNU6B的表達(dá)量。將 HCC細(xì)胞制成石蠟組織，對(duì)比同一細(xì)胞系新鮮細(xì)胞及石蠟包埋細(xì)胞的各個(gè)miRNA表達(dá)量差異。結(jié)果切片厚度30μm，蛋白酶K作用時(shí)間48h時(shí)提取miRNA效果最佳。各HCC細(xì)胞系及臨床 HCC石蠟組織均有不同水平的 miRNA－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及 RNU6B表達(dá)。同一細(xì)胞系新鮮細(xì)胞與石蠟包埋后的各miRNA表達(dá)無(wú)明顯差別。結(jié)論改良后的miRNeasy FFPE提取方法能提取石蠟組織中的miRNA，可重復(fù)性強(qiáng)，可推廣用于臨床各種石蠟包埋組織的miRNA提取。

微RNAs；甲醛；石蠟包埋；肝腫瘤；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

微小RNA（microRNA，miRNA）是一組微小的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNAs（21－25nt），由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后而生成。miRNA現(xiàn)已被證實(shí)在不同的生理過(guò)程，諸如發(fā)育、分化、增殖、凋亡及病毒感染中發(fā)揮著重要的作用［1－5］。最新研究表明，有部分miRNA與肝癌（hepatocellalar car einoma，HCC）等腫瘤的關(guān)系密切。一些HCC組織特異性的miRNA亦被證實(shí)在HCC的發(fā)生過(guò)程中起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用［6－10］。臨床甲醛固定石蠟包埋（formalin－fixed paraffin－embedded，F(xiàn)FPE）標(biāo)本是進(jìn)行醫(yī)學(xué)回顧性研究的最佳資源。雖然新鮮臨床標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定、脫水、浸蠟、包埋等步驟后，mRNA部分已降解或修飾，但從FFPE提取總mRNA進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究仍得到了長(zhǎng)足的進(jìn)展［11－12］。miRNA因?yàn)楸旧眢w積微小，故在FFPE組織中保存相當(dāng)穩(wěn)定，與新鮮組織樣品中miRNA相差無(wú)幾，因此使用FFPE組織進(jìn)行相關(guān)miRNAs的研究已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)使用miRNeasy FFPE試劑盒探討提取肝癌石蠟組織miRNA最優(yōu)化的條件，并對(duì)比使用該方法提取的石蠟標(biāo)本miRNA表達(dá)與相應(yīng)的新鮮細(xì)胞的miRNA表達(dá)的差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人 HCC細(xì)胞系 HepG2，HepB3，SNU449及SNU398均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，分別用DMEM與RPMI 1640培養(yǎng)液（均購(gòu)自美國(guó)Gibcol公司）培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（約1×107），以1 000r／min離心5min，去上清液；D－Hanks平衡鹽溶液（pH 7.2）清洗2遍；最后一次吸出上清液后，沿離心管管壁慢慢地加入1滴蛋清甘油（蛋清∶甘油＝1∶1），用滴管輕輕地把細(xì)胞與蛋清甘油混勻，將細(xì)胞用10%中性緩沖甲醛固定12h，低速離心（200r／min）5min；離心后的細(xì)胞團(tuán)用擦鏡紙包裹，然后進(jìn)行各級(jí)乙醇脫水（各30min）、二甲苯透明（2×30min）、浸蠟（3×30min）及石蠟包埋［18］。石蠟組織標(biāo)本40例，為廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科確診的HCC患者，均含有距癌結(jié)節(jié)2cm以上之癌旁組織。

1.2 FFPE組織含miRNA總RNA的提取 miRNeasy FFPE Kit購(gòu)自比利時(shí)Qiagen分公司。按試劑說(shuō)明書(shū)操作并進(jìn)行相關(guān)步驟不同參數(shù)的測(cè)試，簡(jiǎn)述如下:（1）蠟塊分別切片5、10、20、30、40μm厚，根據(jù)組織大小將2～16張切片置于無(wú)RNA酶的EP管中，加二甲苯1mL，劇烈振蕩10s，20℃下14 000 r／min離心2min，棄上清液。視石蠟多少重復(fù)上述步驟1～3次；（2）加1mL無(wú)水乙醇，振蕩混勻，14 000r／min離心2min，棄上清液；（3）風(fēng)干后加240μL PKD緩沖液及10μL蛋白酶K，振蕩混勻，視組織溶解情況55℃分別孵育15min、1、12、24、36、48h。如組織不溶解，則于24h時(shí)再加10μL蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24h，然后80℃15min；（4）加500μL RBC緩沖液，振蕩混勻，將液體全部轉(zhuǎn)移至gDNA Eliminator離心管，10 000r／min離心30s，棄離心管，保留離心后液體；（5）加入無(wú)水乙醇1.2mL，混勻，將700μL移至miRNeasy Min E－lute離心管，10 000r／min離心15s，棄離心液，重復(fù)上述過(guò)程至全部樣本離心完畢；（6）加500μL RPE緩沖液，10 000r／min離心15s，棄離心液，重復(fù)上述步驟，但第2次離心2min；（7）將miRNeasy Min Elute離心管置入新的收集管，14 000r／min離心5min，棄離心液；（8）將miRNeasy Min Elute離心管置入最后的RNA收集管，加30μL無(wú)RNase 14 000r／min離心1min溶解總RNA（含 miRNA），使用ND－1000Nano Drop檢測(cè)RNA質(zhì)量及濃度。

1.3 實(shí)時(shí)定量RT－PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA表達(dá) miRNA檢測(cè)引物、探針（miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103和RNU6B）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量RT－PCR試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司。細(xì)胞總RNA（含miRNA）使用 miRNeasy Mini Kit（比利時(shí)Qiagen分公司）抽提。取各組總RNA各200ng，加入到含特異引物的15μL的RT反應(yīng)體系中行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2μL cDNA樣本使用 ABI－Prism 7900HT PCR儀（Applied Biosystems）行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA純度 所有標(biāo)本不同條件下抽提的總RNA（含miRNA）OD260／OD280值均在1.80～2.06之間，OD260／OD230值均在1.89～2.08之間。

2.2 切片厚度與 miRNA表達(dá)的關(guān)系 HepG2、HepB3、SNU449及SNU398細(xì)胞均制成蠟塊，并選取3例HCC病例及其對(duì)應(yīng)癌旁正常肝組織進(jìn)行不同厚度與miRNA表達(dá)量關(guān)系的測(cè)試。10個(gè)蠟塊不同切片厚度均能檢測(cè)出相關(guān)miRNA的表達(dá)。但5μm厚的切片Cq值明顯高于其他厚度切片，miRNA表達(dá)量下降。同一miRNA表達(dá)量最高者均為厚30 μm的切片，Cq值低于5μm者1～2循環(huán)不等。30μm組與其他組別相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從5、10μm至20、30μm，各個(gè)miRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但40μm厚之切片miRNA表達(dá)略低于30μm者。HepG2及其中1例HCC和癌旁肝組織各miRNA表達(dá)，見(jiàn)圖1。

2.3 蛋白酶K作用時(shí)間與miRNA表達(dá)的關(guān)系 試劑盒說(shuō)明書(shū)建議蛋白酶K 55℃孵育15min，但孵育15min后肉眼仍可見(jiàn)明顯的組織塊，將孵育時(shí)間增加至1h，組織塊仍未消失。故將孵育時(shí)間延長(zhǎng)至12～24h，直至液體呈現(xiàn)清亮。如一次抽提的組織較多，在24h時(shí)補(bǔ)加一次蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24 h。為觀察蛋白酶K作用時(shí)間對(duì)miRNA表達(dá)的影響，選取1例HCC蠟塊（表面積200mm2），每次切片2張，厚30μm，該例首次加蛋白酶K 24h后，液體仍渾濁，則在24h時(shí)再加第2次蛋白酶K，36h時(shí)液體清亮。不同蛋白酶K作用時(shí)間下總RNA（含 miRNA）質(zhì)量分別為，1h:1 365.87ng／μL；12h:1 855.56ng／μL；24h:2 045.65ng／μL；36h:2 746.87ng／μL；48h:2 718.56ng／μL。以上5組總 RNA 均能檢測(cè)出相關(guān)miRNA的表達(dá)。但1、12及24h之Cq值明顯高于36h及48h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 FFPE組織不同厚度切片與miRNA表達(dá)的關(guān)系

圖2 HCC蛋白酶K作用時(shí)間與miRNA表達(dá)的關(guān)系

2.4 組織量與miRNA表達(dá)的關(guān)系 如一次提取的組織量過(guò)多，有可能導(dǎo)致各個(gè)步驟的離心管阻塞，從而影響提取質(zhì)量和數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)也選取3例HCC組織，進(jìn)行不同組織量（3.0、6.0、12.0、24.0mm3）的對(duì)比（圖3），結(jié)果顯示組織總體積為24.0mm3時(shí)，RNA量最高，并未發(fā)生離心管阻塞現(xiàn)象。其中病例1不同組織體積提取總RNA數(shù)量分別為900.24、1 800.45、2 799.34、4 935.45ng／μL，病 例 2 為 687.45、1 356.45、2 436.34、4 535.45ng／μL，病 例 3 為 865.42、1 564.72、2 987.12、5 432.56ng／μL。各組RNA也經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)，各miRNA表達(dá)量未見(jiàn)明顯差別。

圖3 蛋白酶K作用時(shí)間與miRNA表達(dá)的關(guān)系

2.5 新鮮細(xì)胞及石蠟組織miRNA表達(dá)的對(duì)比 抽提HepG2、HepB3、SNU449及SNU398 4種肝癌細(xì)胞系新鮮細(xì)胞及石蠟組織的總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)各miRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HepB3、SNU449及SNU398結(jié)果未示，見(jiàn)圖4。

圖4 HepG2同一細(xì)胞系新鮮細(xì)胞及石蠟組織miRNA表達(dá)的對(duì)比

3 討 論

石蠟組織中RNA降解或修飾嚴(yán)重，但是miRNA因?yàn)楸旧眢w積較小，大部分石蠟組織中的miRNA未被修飾，保存完整，為利用石蠟組織資源研究miRNA的在各種疾病中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)［12］。miRNeasy FFPE試劑盒能提取純化長(zhǎng)度18個(gè)核苷酸以上的總RNA，獨(dú)特的裂解和孵育條件逆轉(zhuǎn)甲醛對(duì)RNA造成的修飾。并且裂解緩沖液可將RNA從組織切片中有效釋放出來(lái)，同時(shí)避免進(jìn)一步的RNA降解。該試劑盒使用gDNA去除柱有效去除基因組DNA污染。但在組織脫蠟的過(guò)程中，如果缺少完整細(xì)胞膜的保護(hù)，二甲苯或無(wú)水乙醇可溶解部分miRNA，造成miRNA的丟失。成人肝細(xì)胞直徑為20～30μm，故過(guò)薄的切片細(xì)胞膜的完整性受到破壞，直接影響miRNA提取的數(shù)量與質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)將試劑盒推薦的5～10μm切片厚度增加至20、30、40μm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30μm厚度保持完整的miRNA效果最佳。

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。在RNA提取中，蛋白酶K的作用還有降解RNA酶，防止RNA的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K作用時(shí)間對(duì)miRNA數(shù)量及質(zhì)量有著重要的影響，最佳作用時(shí)間應(yīng)為肉眼觀標(biāo)本液體呈現(xiàn)清亮后再延長(zhǎng)12h。在蛋白酶K作用期間，可多次劇烈振蕩，協(xié)助樣品中蛋白質(zhì)的降解。

綜上所述，經(jīng)改良后的miRNA抽提方法穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，提取的含miRNA的總RNA純度高，產(chǎn)量高，多個(gè)miRNA表達(dá)量與從新鮮細(xì)胞提取的miRNA對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)保存15年以上的FFPE組織也可以提取出高質(zhì)量的含miRNA的總RNA。故經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化的從FFPE組織提取miRNA的方法值得推廣使用。

［1］劉強(qiáng)，鄭秀峰，辛永紅.miRNA研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2009，38（15）:1970－1972.

［2］Yang JS，Lai EC.Alternative miRNA biogenesis pathways and the interpretation of core miRNA pathway mutants［J］.Mol Cell，2011；43（6）:892－903.

［3］van Kouwenhove M，Kedde M，Agami R.MicroRNA regulation by RNA－binding proteins and its implications for cancer［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（9）:644－656.

［4］Davis－Dusenbery BN，Hata A.Mechanisms of control of microRNA biogenesis［J］.J Biochem，2010，148（4）:381－392.

［5］Agami R.microRNAs，RNA binding proteins and cancer［J］.Eur J Clin Invest，2010，40（4）:370－374.

［6］Huang S，He X.The role of microRNAs in liver cancer progression［J］.Br J Cancer，2011，104（2）:235－240.

［7］Frenette C，Gish RG.Hepatocellular carcinoma:molecular and genomic guideline for the clinician［J］.Clin Liver Dis，2011，15（2）:307－321.

［8］Negrini M，Gramantieri L，Sabbioni S，et al.microRNA involvement in hepatocellular carcinoma［J］.Anticancer A－gents Med Chem，2011，11（6）:500－521.

［9］Kerr TA，Korenblat KM，Davidson NO.MicroRNAs and liver disease［J］.Transl Res，2011，157（4）:241－252.

［10］Law PT，Wong N.Emerging roles of microRNA in the intracellular signaling networks of hepatocellular carcinoma［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（3）:437－449.

［11］Antonov J，Goldstein DR，Oberli A，et al.Reliable gene expression measurements from degraded RNA by quantitative real－time PCR depend on short amplicons and a proper normalization［J］.Lab Invest，2005，85（8）:1040－1050.

［12］Arzt L，Kothmaier H，Quehenberger F，et al.Evaluation of formalin－free tissue fixation for RNA and microRNA studies［J］.Exp Mol Pathol，2011，91（2）:490－495.

Optimization of MicroRNA extraction method from HCC FFPE tissues＊

Dang Yiwu1，Rong Minhua2，Chen Gang1△
（1.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China；2.Department of Research，Affiliated Cancer Hospital，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi 530021，China）

ObjectiveTo modify and optimize the microRNA（miRNA）extraction and detection approach from hepatocellular carcinoma（HCC）formalin fixed paraffin embedded（FFPE）tissues.MethodsmiRNeasy FFPE kit was performed to investigate the optimizational thickness of sections from HCC FFPE tissues and time of protease K treatment.Afterwards，expression of miR－221，miR－146a，let7－a，miR－191，miR－103and RNU6Bwas detected by real time RT－PCR.The difference of the miRNA expression between fresh cells and FFPE tissues from the same cell line was also compared by real time RT－PCR.Results30μm thickness and 48hof proteinase K treatment were the best parameters to isolate miRNA.Different expression levels of all the miRNAs could be detected in both the HCC cells samples and clinic FFPE samples.There was no significant variation of the miRNA expression between fresh cells and FFPE samples from the same cell lines.ConclusionThe optimizational miRNeasy FFPE method is applicable for miRNA extraction from FFPE tissues.The method is productive and can be popularized for the miRNA isolation for different FFPE tissues.

microRNAs；formaldehyde；paraffin embedding；liver neoplasms；reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.020

A

1671－8348（2012）34－3623－03

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010GXNSFB013059）。 △

，Tel:（0771）5356534；E－mail:chen＿gang＿triones＠163.com。

2012－06－13

2012－09－12）

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