骨橋蛋白抑制FHIT表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖存活＊

王 麗1，劉曉燕1，李 娟1，楊志惠2△
（瀘州醫(yī)學(xué)院:1.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.病理學(xué)教研室，四川瀘州 646000）

目的構(gòu)建骨橋蛋白（OPN）基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，研究其對(duì)SW480細(xì)胞增殖及生存能力的作用機(jī)制。方法構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFP－N1／OPN，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞。采用RT－PCR及免疫印跡法（Western blotting）分別檢測(cè)SW480細(xì)胞OPN基因及蛋白表達(dá)量；Cell Counting Kit－8（CCK－8）測(cè)定細(xì)胞增殖；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力。Western blotting檢測(cè)脆性組氨酸三聯(lián)體基因（FHIT）和蛋白激酶B（PKB／Akt）蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染SW480后，OPN基因獲得很好轉(zhuǎn)錄，OPN蛋白表達(dá)增高，細(xì)胞增殖率（光吸收值）顯著高于轉(zhuǎn)染陰性組（P＜0.05），細(xì)胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯多于對(duì)照組和空載體組（P＜0.05）；FHIT蛋白在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低，Akt蛋白在各組中的表達(dá)無(wú)顯著性差異。結(jié)論 OPN基因通過(guò)抑制FHIT基因表達(dá)，促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖、獨(dú)立存活能力。

骨橋蛋白質(zhì)；結(jié)腸腫瘤；脆性組氨酸三聯(lián)體基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化、帶負(fù)電荷、親水性的分泌型糖蛋白［1］。OPN蛋白分子結(jié)構(gòu)內(nèi)有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）結(jié)構(gòu)域，其通過(guò)RGD序列能與多種整合素受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞趨化、黏附和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胃癌和肺癌等腫瘤組織OPN高表達(dá)，并且與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)［2－3］，但具體作用機(jī)制不明確，有待進(jìn)一步研究。本研究擬構(gòu)建OPN基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，探討OPN對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及存活能力的影響及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，E.coli TG1菌株及pEGFP－N1載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 脂質(zhì)體Lipofectamne2000、LA Taq with GC Buffer PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自Takara公司；DNA片段快速回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于Qiagen公司；Cell Counting Kit－8（CCK－8）購(gòu)自上海同仁化學(xué)研究所；OPN 鼠抗人多克隆抗體、脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT）兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）兔抗人多克隆抗體購(gòu)自上海康成生物工程有限公司；β－actin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 方法

1.3.1 重組表達(dá)載體pEGFP－N1／OPN的構(gòu)建與鑒定

1.3.1.1 OPN基因的擴(kuò)增 提取結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116總RNA，按說(shuō)明書(shū)合成cDNA。根據(jù)OPN序列NM＿001040060設(shè)計(jì)引物，上游添加X(jué)hoⅠ酶切位點(diǎn)，下游添加BamHⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列為F:ACC TCG AGG CCA TGA GAA TTG CAG TGA TTT G，R:TAG GAT CCC GAT TGA CCT CAG AAG ATG CAC T，產(chǎn)物長(zhǎng)度為863bp。

1.3.1.2 OPN基因的克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收863bp處DNA帶，與7Z載體連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，篩選白斑，提取質(zhì)粒，菌落PCR鑒定及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，陽(yáng)性克隆送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.1.3 重組表達(dá)載體pEGFP－N1／OPN的構(gòu)建與鑒定 用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切7Z／OPN，酶切產(chǎn)物與同樣的酶雙酶切的克隆載體pEGFP－N1連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFPN1／OPN，轉(zhuǎn)化E.coli TG1。篩選重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子并提取重組質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后，陽(yáng)性克隆送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列分析。

1.3.2 pEGFP－N1／OPN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株以含10%胎牛血清的L－15培養(yǎng)液，在37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW480株，轉(zhuǎn)染前1天以3×105密度接種對(duì)數(shù)期SW480于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)達(dá)到90%融合時(shí)，隨機(jī)分為3組:空白組（用無(wú)菌水代替質(zhì)粒），對(duì)照組（加空載體pEGFP－N1）和實(shí)驗(yàn)組（pEGFP－N1／OPN）。每孔加入2mL 無(wú)血清培養(yǎng)基，分別配制溶液1（240μL無(wú)血清培養(yǎng)基及10μL lip 2 000per well，溫育5min）和溶液2（240μL無(wú)血清培養(yǎng)基及4 μg質(zhì)粒per well），混合溶液1、2于室溫下放置20min后逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5%CO2中保溫6 h，之后更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)48～72h，熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。RT－PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN表達(dá)；免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN蛋白表達(dá)量。

1.3.3 轉(zhuǎn)染OPN后SW480生物學(xué)功能研究

1.3.3.1 CCK－8測(cè)定細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，以5×104密度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為空白組，空載體組和實(shí)驗(yàn)組，每組3復(fù)孔，按常規(guī)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更換含有血清的全培養(yǎng)基后分別培養(yǎng)24、48、72h，在各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)板，每孔加入10μL CCK－8，37℃下繼續(xù)孵育2h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度值（A）。

1.3.3.2 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞，用含20%胎牛血清的L－15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／L。制備0.7%和1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖液，等比例分別與2×L－15培養(yǎng)基混合成上層和下層，加1.5mL下層培養(yǎng)基于6孔板凝固后，將約2 000個(gè)細(xì)胞與1.5mL上層培養(yǎng)基混合，加到已凝固的底層瓊脂上，形成雙瓊脂層，置于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)10d，倒置顯微鏡下觀察，鏡下（×40）隨機(jī)挑選10個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 Western blotting檢測(cè)FHIT蛋白和 Akt蛋白 按Western blotting常規(guī)操作對(duì)3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞行FHIT、Akt、βactin蛋白檢測(cè)，結(jié)果以累積光密度比值（FHIT IOD／β－actin IOD）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN基因及蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48h后檢測(cè)OPN基因在SW480中的表達(dá)，結(jié)果顯示，空白組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有非常微弱的目的條帶，而重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)850bp左右目的條帶，3組細(xì)胞均在263bp處出現(xiàn)GAPDH目的條帶，表明重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染之后外源OPN獲得很好轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染72h后檢測(cè)OPN基因在SW480中的表達(dá)，檢查結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞經(jīng)pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染后OPN蛋白表達(dá)增高，而空白組和空載體組OPN蛋白表達(dá)弱，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖1、2。

2.2 細(xì)胞增殖分析 CCK－8法檢測(cè)3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染pEGFP－N1／OPN質(zhì)粒組與對(duì)照組和空載體組相比，任何時(shí)間段轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖程度均出現(xiàn)明顯增強(qiáng)，表明OPN具有促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖的作用，而對(duì)照組和空載體組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 RT－PCR檢測(cè)OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后的表達(dá)

圖2 Western blotting檢測(cè)OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后的表達(dá)

2.3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pEGFP－N1／OPN后，SW480細(xì)胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯多于對(duì)照組和空載體組，3組細(xì)胞每視野平均克隆個(gè)數(shù)分別為:21.00±3.16，14.40±2.30，14.60±1.14，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12.74，P＜0.05）。

圖3 Western blotting檢測(cè)OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后FHIT和Akt蛋白的表達(dá)

2.4 Western blotting檢測(cè)FHIT蛋白和Akt蛋白 FHIT IOD／β－actin IOD在空白組、空載體組和實(shí)驗(yàn)組分別為0.156±0.008、0.165±0.008、0.044±0.006，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝248.47，P＝0.000），兩兩比較顯示實(shí)驗(yàn)組與空白組、空載體組均有顯著性差異，空白組和空載體組間變化不明顯（P＝0.186）；Akt蛋白在3組間的表達(dá)分別為0.022±0.004、0.024±0.003、0.024±0.002，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.205，P＝0.820），見(jiàn)圖3。

表1 CCK－8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響±s）

表1 CCK－8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響±s）

組別A450 24h 48h 72h空白組0.277±0.010 0.335±0.030 0.457±0.051空載體組 0.232±0.023 0.323±0.028 0.424±0.027實(shí)驗(yàn)組 0.358±0.038 0.614±0.055 0.877±0.025 F 17.763 51.512 147.534 P 0.003 0.000 0.000

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與所處的微環(huán)境密切相關(guān)，因此細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。新近發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如OPN等，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、侵襲和抗凋亡等方面都發(fā)揮著重要的作用。OPN與其受體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的信號(hào)通路引起相應(yīng)基因表達(dá)的改變，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［4－5］。OPN與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但OPN促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究［6］。

本研究結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染SW480后，OPN基因獲得很好轉(zhuǎn)錄，OPN蛋白表達(dá)增高，OPN能促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖，軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯增多。為研究其分子機(jī)制，Western blotting檢測(cè)FHIT蛋白和Akt蛋白在轉(zhuǎn)染OPN后SW480細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白組和空載體組相比，F(xiàn)HIT蛋白在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)顯著降低；而Akt蛋白在各組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)包括核因子－κB在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子參與多種生命活動(dòng)。研究表明，PI3K／Akt途徑的活化參與多種腫瘤的發(fā)生，抑制該通路可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞在面臨生存壓力時(shí)，OPN通過(guò)與αvβ3整合素結(jié)合，增強(qiáng)Akt Ser473位點(diǎn)的磷酸化作用，激活PI3K／Akt途徑，拮抗生存壓力，提升細(xì)胞存活能力。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OPN并沒(méi)有引起Akt蛋白表達(dá)量增加。

FHIT位于人類3號(hào)染色體短臂3p14.2。研究表明，F(xiàn)HIT在人類許多腫瘤組織或細(xì)胞系中呈現(xiàn)高頻率異常，在許多腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中，F(xiàn)HIT基因呈現(xiàn)多發(fā)性、廣泛性的純合性或雜合性缺失，為多種腫瘤的候選抑制基因［7－8］。作為腫瘤抑制基因，它的缺失或失活將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和惡性度的升高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN轉(zhuǎn)染組FHIT蛋白表達(dá)降低，故推測(cè)OPN通過(guò)抑制FHIT表達(dá)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、存活。

本研究構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP－N1／OPN，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞。結(jié)果顯示OPN通過(guò)降低FHIT蛋白表達(dá)促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖存活能力，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

［1］Denhardt DT，Guo X.Osteopontin:aprotein with diverse functions［J］.FASEB J，1993，7（15）:1475－1482.

［2］Coppola D，Szabo M，Boulware D.Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies［J］.Clin Cancer Res，2004，10（1Pt 1）:184－190.

［3］Uhlmann ME，Georges RB，Boleij A，et al.Influence of osteopontin expression on the metastatic growth of CC531 rat colorectal carcinoma cells in rat liver［J］.Cancer Gene Ther，2011，18（11）:795－805.

［4］Chakraborty G，Jain S，Behera R，et al.The multifaceted roles of osteopontin in cell signaling，tumor progression and angiogenesis［J］.Curr Mol Med，2006，6（8）:819－830.

［5］Rittling SR，Chambers AF.Role of osteopontin in tumour progression［J］.Br J Cancer，2004，90（10）:1877－1881.

［6］Georges R，Adwan H，Zhivkova M，et al.Regulation of osteopontin and related proteins in rat CC531colorectal cancer cells［J］.Int J Oncol，2010，37（2）:249－256.

［7］Siprashrili Z，Sozzi G，Barnes LD，et al.Replacement of Fhit in cancer cells suppresses tumorigenicity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（25）:13771－13776.

［8］盧德成，羅佐杰，冼晶.腎上腺皮質(zhì)腫瘤增殖抗原和脆性組氨酸二聯(lián)體表達(dá)的相關(guān)性及意義［J］.中國(guó)綜合臨床，2008，24（8）:753－754.

OPN regulates the FHIT protein expression to promote the proliferation and survival of SW480＊

Wang Li1，Liu Xiaoyan1，Li Juan1，Yang Zhihui2△（
1.Medical Molecular Biology Laboratory；2.Pathology Teaching and Research Section；Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan646000，China）

ObjectiveTo construct an OPN eukaryotic expression vector，and evaluate its effects on proliferation and survival in SW480colon cancer cells in vitro，exploring the possible mechanism.MethodsOPN gene was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP－N1，after sequencing，the vector was then transfected into SW480cells.The OPN gene and protein expression in transfected cells were demonstrated by RT PCR and Western blotting respectively.The impact on proliferation in transfected SW480cells were investigated by CCK－8method，anchorage independent growth was measured using soft agar assay.Western blotting was used to analyzing the protein of fragile histidine triad gene（FHIT）and protein kinase B（PKB／Akt）.ResultsThe levels of OPN gene and protein in colon cancer SW480cells were distinctly increased after transfection with pEGFP－N1／OPN.The OD450 value of OPN transfection group was higher than negative control group showed by CCK－8method（P＜0.05）.They could also significantly increase anchorage independent growth in vitro.FHIT protein was significantly increased in SW480cells transfected with pEGFP－N1／OPN.ConclusionIn SW480colon cancer cells，OPN was involved in promotion proliferation and survival，by regulating the FHIT protein expression.

osteopontin；colonic neoplasms；fragile histidine triad gene

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.003

A

1671－8348（2012）34－3583－03

四川省科技廳科研項(xiàng)目（07JY029－134）；四川省教育廳科研項(xiàng)目（07ZB110）。 △

，Tel:（0830）3160331；E－mail:yzhih73＠126.com。

2012－06－13

2012－09－12）