李玉榮，武現(xiàn)軍，吳 浩，陳立功，霍書英，高玉紅

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071001；2.河北省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，河北保定071001；3.保定市畜牧水產(chǎn)局，河北保定071051）

朊病（Prion disease）又稱傳染性海綿狀腦?。═ransmissible spongiform encephalopathies，TSEs），是由朊病毒引發(fā)人和動(dòng)物的一組中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。其主要病原分子是由正常細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞型朊蛋白（cellular prion protein，Pr PC）構(gòu)象改變而成的具有蛋白酶抗性的致病型朊蛋白（scrapie prion protein，Pr PSc）。朊病毒主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理學(xué)變化，包括神經(jīng)元空泡化、喪失和膠質(zhì)細(xì)胞增生［1］。盡管國(guó)內(nèi)外展開大量的研究，但迄今為止，人們尚未能完全掌握Pr PSc聚集引起朊病發(fā)生的確切機(jī)制。

BV－2小膠質(zhì)細(xì)胞系保留了小膠質(zhì)細(xì)胞的表型和功能特征，常用于朊病的研究［2－3］。體外合成人源朊蛋白多肽Pr P106－126，對(duì)應(yīng)人Pr P氨基酸序列106－126，具有與Pr PSc相同的理化性質(zhì)，包括富含β－折疊成分、可自發(fā)形成淀粉樣纖維和具有相對(duì)蛋白酶 K 抗性等［4－5］。Pr P106－126 可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的不同組織來源的原代神經(jīng)元的死亡［6］，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡和改變視網(wǎng)膜的電位［7］，成為研究朊病毒的良好病毒模型［4－7］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是TSEs的一個(gè)重要特征，且早于神經(jīng)元的退行性變化［8］。增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過降低谷氨酸的攝入，導(dǎo)致胞外高谷氨酸水平，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性［9］。體外研究表明，Pr P106－126誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并釋放一系列的活性因子如IL－1和IL－6，從而促進(jìn)多因子誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化［9］。但目前并不能確定哪一種或幾種物質(zhì)起主要的作用［10］，因此，本文選擇Pr P106－126作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，以檢測(cè)PrP106－126對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的間接影響。另因Pr P106－126作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)其胞內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸表達(dá)變化知之甚少，僅見有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、谷氨酰胺、IL－1R、IL－6R和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的報(bào)道［8－11］。星形膠質(zhì)細(xì)胞合成并分泌層黏連蛋白（Laminin，LN）和纖黏連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）到胞外基質(zhì)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)［12］，且在氧化壓力存在的條件下胞外基質(zhì)中LN、FN的表達(dá)增加以阻止神經(jīng)元的死亡［13］。本文擬研究PrP106－126對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接和間接作用，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性和LN、FN的表達(dá)水平，為闡明朊病的發(fā)生機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

朊蛋白多肽Pr P106–126：KTNMKHMAGA AAAGAVVGGLG，打亂序列 Scr（LVGAHAGKMGANTAKAGAMVG）作為陰性對(duì)照，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；干粉多肽以PBS（p H 7.4）溶解，制成5 mmol／L的儲(chǔ)備液，凍存于－20℃；小膠質(zhì)細(xì)胞BV－2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物所；鼠單克隆抗體FN、LN為美國(guó)Santa公司產(chǎn)品；鼠單抗β－actin抗體、二抗羊抗鼠為北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；ECL超敏發(fā)光液為北京普利萊基因技術(shù)公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；TRIZOL試劑為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；M－MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Taq DNA聚合酶為北京博大泰克生物公司產(chǎn)品；MTT試劑盒為北京碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 參考Brown D R等［8］方法稍加改進(jìn)。出生1 d內(nèi)的SD大鼠，4只～5只，去腦膜，取大腦皮層，剪碎并吹打，0.5mL／L胰酶消化，過篩并培養(yǎng)于75 cm2培養(yǎng)瓶。常規(guī)培養(yǎng)至14 d細(xì)胞融合，通過振蕩法移去小膠質(zhì)細(xì)胞和其他雜質(zhì)細(xì)胞，260 r／min 2 h，黏附細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞；用胰酶處理并繼續(xù)培養(yǎng)30 min，其中混合的小膠質(zhì)細(xì)胞黏附于培養(yǎng)瓶而星形膠質(zhì)細(xì)胞仍存在于培養(yǎng)基中；而后，星形膠質(zhì)細(xì)胞分別種植于24孔和96孔培養(yǎng)板中2 h，通過更換培養(yǎng)基移去沒有黏附的雜質(zhì)細(xì)胞以進(jìn)一步純化。采用星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的膠原纖維酸性蛋白（GFAP）多抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。常規(guī)操作，在第一抗孵育時(shí)采用PBS稀釋的1∶500兔抗人GFAP抗血清，最后采用DAB顯色法觀察。

1.2.2 BV－2小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基 BV－2細(xì)胞以4×104細(xì)胞／孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后，分別加入 0 及 80μmol／L Pr P106－126，培養(yǎng)2 d后，收集培養(yǎng)基分別為條件培養(yǎng)基MiCM（conditioned medium from microglia）和 MiCMPrP106－126（為方便描述，下文稱為 MiCMPrP106）。1.2.3 試驗(yàn)分組 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別處理如下：空白對(duì)照、Scr處理組（添加80μmol／L Scr）、Pr P106－126處理組（添加80μmol／L Pr P106－126）、MiCM 組（更換培養(yǎng)基為 MiCM）和 MiCMPr P106組（更換培養(yǎng)基為MiCMPr P106），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。96孔板分別于24 h和48 h檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，24孔板于48 h用于測(cè)定LN及FN的表達(dá)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性 每孔加入5 g／L MTT，孵育3 h，去上清，每孔加150 μL DMSO，避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè) OD570 nm值。

1.2.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞LN和FN蛋白水平表達(dá)檢測(cè) 以細(xì)胞總蛋白提取試劑分別從5個(gè)不同處理組中提取細(xì)胞蛋白。自各組取等量樣品在SDS－聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，進(jìn)行常規(guī) Western Blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)膜后，一抗4℃ 孵育過夜，二抗作用1 h，發(fā)光液作用后，X光片顯影、定影。其中β－actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞LN和FN mRNA表達(dá)檢測(cè)

1.2.6.1 cDNA的合成 利用Trizol試劑分別從5個(gè)不同處理組中提取總RNA，以等量的RNA為模板，Oligo（d T）為引物，按照 M－MLV反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行，cDNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 基因PCR擴(kuò)增及DNA片段的瓊脂糖檢測(cè) 引物參考GenBank上已發(fā)表的序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物如下：β－actin，上游引物5′－TGCTGTCCCTGTATGCCTVCTG－3′和下游引物5′－TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG－3′；LN，上 游引物5′－GGCTTCTATGACCTGAGTGC－3′和下游引物5′－GCCCAAGATTGGCTTCCTC－3′；FN 上游引物5′－CCGTGGAGTAGTTGGTTAGT－3′和下游引 物 5′－TCAGGGCTTGAGTAGGTCA－3′。 采 用20μL反應(yīng)體系，分別取不同組別2μL cDNA，常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以β－actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量PCR。應(yīng)用Kodak凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照判別，并以Image tool 3.0圖像分析軟件分析EB染色情況，并得出目的基因與β－actin灰度比值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 12.0軟件包，進(jìn)行單因子方差分析，有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

采用文獻(xiàn)［8］方法培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，圖1A為相差顯微鏡圖，為經(jīng)振蕩和利用貼壁時(shí)間差純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，可見以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的底層，相互銜接，胞間發(fā)生交錯(cuò)聯(lián)系，生長(zhǎng)良好；其上層有少量震蕩后未貼壁的細(xì)胞。圖1B為進(jìn)一步純化后，DAB顯色GFAP抗體標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果，鏡下可見反應(yīng)陽性細(xì)胞胞漿和突起為黃褐色，即細(xì)胞表達(dá)GFAP。GFAP陽性率很高，說明所獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度較高。

圖1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（A）及鑒定（B）（200×）Fig.1 Morphological observation（A）and identification（B）of primarily cultured astrocytes（200×）

2.2 Pr P106－126在MiCM存在時(shí)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性在MiCM－Pr P106處理24 h和48 h后顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），分別提高27% 和35% ，且活性提高呈一定的時(shí)效性；相對(duì)于MiCM分別提高20%（P＜0.01）和28%（P＜0.01）。單獨(dú)Pr P106－126或MiCM對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響（P＞0.05）。而Scr處理組未見明顯變化（圖2）。

圖2 培養(yǎng)48 h星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性Fig.2 Proliferation viability of the primary astrocyte cultured for 48 h

2.3 Pr P 106－126對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞FN和LN m RNA表達(dá)的影響

本研究采用半定量法對(duì)FN和LN的m RNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，圖3 A所示為FN、LN和βactin基因的半定量擴(kuò)增結(jié)果，圖3 B為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。處理48 h后，F(xiàn)N的表達(dá)，MiCMPr P106較正常對(duì)照組提高90%（P＜0.01），較 MiCM 提高86%（P＜0.01），且其他組與正常對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。LN的表達(dá)，Pr P106－126與 MiCMPr P106組分別較正?？瞻讓?duì)照提高55%（P＜0.01）、70% （P＜0.01），MiCMPr P106較 MiCM 提高53%（P＜0.01），而MiCM組與正常對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），可見 Pr P106－126可以促進(jìn)LN的表達(dá)。而Scr處理組未見明顯變化。

圖3 半定量RT－PCR檢測(cè)Pr P106－126對(duì)FN和LN的表達(dá)的影響Fig.3 The effects of Pr P on the mRNA expression of FN and LN detected by RT－PCR

2.4 Pr P 106－126對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞FN和LN蛋白水平表達(dá)的影響

本研究采用Western blot法對(duì)FN和LN的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，圖4 A所示為FN、LN和β－actin蛋白 Western blot檢測(cè)結(jié)果，圖4 B為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。PrP106－126處理48 h后，F(xiàn)N的表達(dá)，MiCMPrP106較正常對(duì)照組提高50%（P＜0.01），較MiCM 提高44%（P＜0.01），而 MiCM 或Pr P106－126組與正常對(duì)照相比差異不顯著（P＞0.05），與m RNA水平檢測(cè)結(jié)果相一致，可見單獨(dú)Pr P106－126與MiCM均不能改變FN的表達(dá)水平，而只有MiCMPr P106－126提高了星形膠質(zhì)細(xì)胞FN的表達(dá)。LN的表達(dá)，Pr P106－126 與 MiCMPrP106－126組分別較正?？瞻讓?duì)照提高43%（P＜0.01）、55%（P＜0.01），MiCMPr P106 較 MiCM 提 高 53% （P＜0.01），而 MiCM 與正常對(duì)照無顯著性差異（P＞0.05）；可見PrP106－126可以促進(jìn)LN的表達(dá)，單獨(dú)MiCM不能促進(jìn)LN的表達(dá)。而Scr處理組未見明顯變化（P＞0.05）。

圖4 Western blot檢測(cè)PrP106－126對(duì)FN和LN的表達(dá)的影響Fig.4 The effects of PrP on expression of FN and LN detected by Western blot

3 討論

Pr P106－126促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖具有小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)PrP106－126處理的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液可以顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，這與 Brown D R 等［8］的結(jié)論是一致的；而Pr P106－126直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞則無促進(jìn)作用，可見Pr P106－126對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖依賴于活化小膠質(zhì)細(xì)胞的存在。研究表明，在朊病發(fā)生、發(fā)展過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞所釋放的活性物質(zhì)有組織蛋白S、細(xì)胞因子IL－1、IL－6及淋巴細(xì)胞趨化因子等，但這一活化作用不同于細(xì)菌脂多糖或淀粉體等作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)物［14］。而這些因子的部分受體在星形膠質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，包括IL－1R、IL－6R，這可以解釋小膠質(zhì)細(xì)胞釋放因子參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和增生［15］。另外，Pr P106－126可直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞而導(dǎo)致氧自由基和細(xì)胞因子的釋放而直接或間接參與朊病的發(fā)生。

本研究表明Pr P106－126可以直接促進(jìn)LN的表達(dá)，但是對(duì)FN表達(dá)的促進(jìn)作用需要小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。LN是一高分子質(zhì)量的異源糖蛋白（800 ku），由3條肽鏈構(gòu)成，2短（α、β）1長(zhǎng)（γ）。LN 同其配體結(jié)合實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)節(jié)，研究表明即便單獨(dú)表達(dá)γ鏈，足以實(shí)現(xiàn)其促神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用。近來研究表明PrPC可以與LN的γ高親和力結(jié)合，這一結(jié)合對(duì)Pr PC的生理功能有重要的作用，經(jīng)抗體結(jié)合后Pr PC相應(yīng)功能消失［16］。Pr PC結(jié)合LN并與37 ku／67 ku LN受體相互作用，參與20%～50% 細(xì)胞膜蛋白Pr PC的內(nèi)化。Pr PC、LN二者與37 ku／67 ku LN受體同位點(diǎn)結(jié)合這一特點(diǎn)，導(dǎo)致Pr PC與LN競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，PrP106－126導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Pr PC的高表達(dá)［1］，這意味著LN的增加可以代償性增加與LN受體的作用位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)各自的信號(hào)傳導(dǎo)［15］。LN與Pr PC之間的關(guān)系同時(shí)也解釋在誘導(dǎo)表達(dá)方面LN與FN的不同，LN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖之間沒有直接的關(guān)系，如本研究的結(jié)果所述，Pr P106－126促進(jìn)LN的表達(dá)，但不促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。但是，本研究的結(jié)果MiCMP106促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞FN的表達(dá)與細(xì)胞增殖，意味著FN參與細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［17］一致，但同細(xì)胞系，星形膠質(zhì)細(xì)胞FN的表達(dá)和胞間沉積受多種因素的調(diào)節(jié)，如bFGF和TGF，在Pr P106－126作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的某些因子可有效刺激FN的表達(dá)，F(xiàn)N的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖有關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞是一個(gè)分化程度比較低的細(xì)胞，相比于神經(jīng)元可以通過增殖以逃避Pr P106－126的毒性。

總之，本文首次發(fā)現(xiàn)PrP106－126促進(jìn)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)蛋白FN和LN的表達(dá)，且Pr P 106－126對(duì)FN這種作用是小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性的。這可能只是早期的變化，需要強(qiáng)調(diào)的是本試驗(yàn)是在細(xì)胞上完成的，有必要在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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