伍曉紅，儲(chǔ)岳峰，張 軒，趙 萍，高鵬程，賀 英，逯忠新＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046；2.西藏昌都左貢縣獸醫(yī)站，西藏左貢854400）

牛支原體（Mycoplasma bovis）主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎等［1］。該病原于1961年首次在美國(guó)患有乳房炎的病牛中分離得到，之后在歐洲和北美流行并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。辛九慶等［3］首次在國(guó)內(nèi)患肺炎犢牛的肺臟中分離到牛支原體，從而證實(shí)了國(guó)內(nèi)部分地區(qū)也存在牛支原體肺炎的流行。冉智光等［4］又從患嚴(yán)重肺炎和關(guān)節(jié)炎的調(diào)入肉牛中分離出了牛支原體，進(jìn)一步證實(shí)牛支原體感染已經(jīng)對(duì)中國(guó)部分地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響。

有關(guān)研究報(bào)道，在健康牛呼吸道中幾乎分離不到牛支原體，只有在感染牛的呼吸道中能夠分離到，并經(jīng)常引起臨床發(fā)?。?］。近年來(lái)，在我國(guó)不同地區(qū)相繼有犢牛肺炎病例發(fā)生，由于在臨床癥狀和病理剖檢變化方面與牛傳染性胸膜肺炎非常相似，曾引起養(yǎng)牛業(yè)界的恐慌［6］。2011年，甘肅通渭某牛場(chǎng)出現(xiàn)嚴(yán)重的犢牛呼吸系統(tǒng)感染，主要表現(xiàn)為肺炎癥狀，病死率達(dá)10%。本研究對(duì)送檢的犢牛肺臟病料進(jìn)行了支原體分離和鑒定，并通過(guò)16 S RNA基因測(cè)序進(jìn)行了分子鑒定，證實(shí)為牛支原體。

1 材料與方法

1.1 材料

采集甘肅通渭發(fā)病犢牛病變肺臟樣品2份；用Thiaucourt＇s支原體培養(yǎng)基分離［7］。

1.2 方法

1.2.1 病原分離 無(wú)菌取約1 g肺組織，加2 mL液體培養(yǎng)基研磨勻漿，1 000 r／min離心5 min取上清，按1∶10倍比稀釋接種至液體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種2管，共接種3個(gè)稀釋度，置37℃培養(yǎng)。每隔48 h進(jìn)行一次傳代或盲傳。傳至2代后取培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁者或輕微渾濁者，接種于固體培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h～96 h，挑取單個(gè)克隆接種液體培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)后再接種固體培養(yǎng)基，至少3次克隆純化后，用甘油將培養(yǎng)物保存于－70℃。

1.2.2 生化試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［8］的方法進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.2.3 PCR鑒定 使用北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提純培養(yǎng)物基因組DNA。利用牛支原體特異性引物P1：5′－TTTTAGC － TCTTTTTGAACAAAT－3′， P2： 5′－GGCTCTCATT－AAGAATGTC－3′對(duì)分離物進(jìn)行PCR 鑒定［9］。

1.2.4 16 SrRNA序列測(cè)定與分析 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)［10］報(bào)道的方法擴(kuò)增支原體培養(yǎng)物16 SrRNA基因序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1.6 kb。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中送去南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用Lasergene 7.01軟件中的Meg Align程序?qū)y(cè)序結(jié)果與部分支原體菌株的16 SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 病原分離

在液體培養(yǎng)基中盲傳2代后，2份樣品的培養(yǎng)基顏色開(kāi)始變黃，呈輕微混濁狀。將培養(yǎng)物純化，獲得2份純培養(yǎng)物，分別命名為GT－01和GT－02。GT－01和GT－02在固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)，72 h后可觀察到針尖狀大小的菌落，低倍普通光學(xué)顯微鏡下可看到菌落呈圓形，邊緣整齊，具有典型的“油煎蛋狀”形態(tài)（圖1）。

圖1 GT－01株的純化菌落形態(tài)（40×）Fig.1 Colony of the isolate GT－01（40×）

2.2 生化試驗(yàn)

GT－01和GT－02培養(yǎng)物均對(duì)洋地黃皂甙敏感，具有磷酸酯酶活性，四氮唑還原試驗(yàn)陽(yáng)性，但不能水解葡萄糖、甘露醇、精氨酸，不消化酪蛋白，與已報(bào)道牛支原體生化特性相符。

2.3 PCR鑒定

利用牛支原體特異性的P1和P2引物可以從GT－01和GT－02基因組總DNA中擴(kuò)增出約1 911 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符（圖2）。

圖2 牛支原體分離物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of mycoplasma isolates

2.4 16 S rRNA基因序列分析

16 S rRNA基因序列分析表明，GT－01和GT－02序列同源性為99.9%；與GenBank中公布的其他5株不同的支原體16 S rRNA基因進(jìn)行同源性分析，GT－01和GT－02與牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45同源性分別高達(dá)99.4%和99.6%。

圖3 GT－01和GT－02分離株16 S rRNA基因序列的同源性分析Fig.3 Homology analysis of 16 S rRNA gene of the isolates GT－01 and GT－02

3 討論

盡管牛支原體可引起多系統(tǒng)感染，但呼吸道感染是牛支原體主要的致病表型之一，牛支原體肺炎已成為當(dāng)前世界上許多國(guó)家和地區(qū)牛的重要呼吸道傳染病，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。感染?？赏ㄟ^(guò)呼吸道傳播成為主要的傳染源，其傳播過(guò)程可持續(xù)幾個(gè)月甚至幾年。Laak E A等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在荷蘭育肥牛場(chǎng)中牛支原體感染率在20%以上。英國(guó)的某項(xiàng)調(diào)查顯示，55個(gè)牛場(chǎng)中有半數(shù)牛場(chǎng)可檢測(cè)到牛支原體特異性抗體［12］。在瑞士，牛支原體導(dǎo)致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道疾病的50%，感染牛群生長(zhǎng)速度下降8%［13］。2008年，我國(guó)湖北省新從外地引進(jìn)肉牛發(fā)生了以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病，引起了很高的發(fā)病率和病死率，后確定該病為牛支原體引起的“傳染性牛支原體肺炎”［10－14］，證實(shí)了該病在我國(guó)流行，此后又蔓延至重慶等全國(guó)等多個(gè)地區(qū)，給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了較大危害。本研究首次從甘肅地區(qū)臨床表現(xiàn)肺炎的犢牛肺組織中分離到牛支原體，證實(shí)該病已在甘肅省存在，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)提出了新的挑戰(zhàn)。

在牛支原體引起的呼吸系統(tǒng)感染臨床診斷中，由于臨床癥狀和病理剖檢變化與牛傳染性胸膜肺炎（牛肺疫）類(lèi)似，需進(jìn)行較為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病原學(xué)和血清學(xué)診斷兩個(gè)方面。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有有效的血清學(xué)診斷方法，國(guó)外試劑盒價(jià)格昂貴，且需要采集感染不同時(shí)期的血清進(jìn)行比對(duì)以輔助診斷。因此，病原分離和分子鑒定成為目前較為可行的確診依據(jù)［3］。本試驗(yàn)使用的特異性PCR引物，對(duì)無(wú)乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2和牛肺疫支原體PG1株均無(wú)交叉擴(kuò)增，與原文獻(xiàn)報(bào)道的可用于鑒別牛支原體和無(wú)乳支原體結(jié)果一致［9］，因此具有較好的特異性，是一種快捷方便的分子診斷手段。

16 SrRNA基因序列分析表明，來(lái)自于同一牛場(chǎng)的GT－01和GT－02兩個(gè)分離株同源性為99.9%，表明二者之間具有一定的差異，這是否意味著同一牛場(chǎng)可能同時(shí)流行不同的菌株，或者牛支原體在流行過(guò)程中能發(fā)生快速變異，尚需要進(jìn)一步研究。與GenBank中的其它支原體種的序列比對(duì)分析表明，分離株與牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45同源性分別為99.4%和99.6%，而與無(wú)乳支原體的同源性僅為98.6%，進(jìn)一步從基因序列水平上證實(shí)了分離株為牛支原體。

2008年以來(lái)，我國(guó)已有多個(gè)省市已證實(shí)牛支原體肺炎的流行，本試驗(yàn)首次證實(shí)了該病在甘肅省存在，表明該病在我國(guó)有逐漸蔓延之勢(shì)。隨著我國(guó)奶牛業(yè)和肉牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牛群的調(diào)運(yùn)將會(huì)愈加頻繁，牛支原體傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)也將提高，應(yīng)引起各級(jí)獸醫(yī)部門(mén)的重視，提高對(duì)牛支原體肺炎的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)對(duì)該病的防控措施。

［1］Pfutzner H，Sachse K.Mycoplasma bovis as an agent of mastitis，pneumonia，arthritis and genital disorders.Scientific and technical review［J］.Offices International Des Epizooties，1996，15（4）：1477－1494.

［2］Hale H H，Helmboldt C F，Plastridge W N，et al.Bovine mastitis caused by Mycoplasma species［J］.Cornell Vet，1962，52（4）：582－591.

［3］辛九慶，李 媛，郭 丹，等.國(guó)內(nèi)首次從患肺炎牛肺臟中分離到牛支原體［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（9）：661－664.

［4］冉智光，謝建華，駱 璐，等.我國(guó)部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：40－43.

［5］Gourlay R N，Thomas L H，Wyld S G.Increased severity of calf pneumonia associated with the appearance of Mycoplasma bovis in a rearing herd［J］.Vet Recd，1989，124（16）：420－422.

［6］辛久慶.難道牛肺疫又卷土重來(lái)了嗎？——牛呼吸疾病的認(rèn)識(shí)與防治［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2010（4）：6－7.

［7］邵 倩，儲(chǔ)岳峰，何生虎，等.牛支原體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和培養(yǎng)基篩選［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（3）：549－551.

［8］吳移謀，葉元康.支原體學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：48.

［9］Rifatbegovic M，Assuncao P，Poveda J B，et al.Isolation of Mycoplasma bovis from the respiratory tract of cattle in Bosnia and Herzegovina［J］.Vet Rec，2007，160（14）：484－485.

［10］石 磊，龔 瑞，尹爭(zhēng)艷，等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（5）：629－633.

［11］Laak E A，Noordergraaf J，Dieltjes H，et al.Prevalence of mycoplasmas in the respiratory tracts of pneumonic calves［J］.J Vet Med，Series B，1992，39（8）：553－562.

［12］胡長(zhǎng)敏，石 磊，龔 瑞，等.牛支原體病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（8）：73－77.

［13］Poumarat F，Le Grand D，Philippe S，et al.Efficacy of spectinomycin against Mycoplasma bovis induced pneumonia in conventionally reared calves［J］.Vet Microbiol，2001，80（1）：23－35.

［14］石 磊，龔 瑞，尹爭(zhēng)艷，等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：572.