楊勝男，鄭增忍，張樂萃，王 娟，曲志娜，黃秀梅，李玉清

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

彎曲菌（Campylobacter）是重要的食源性人獸共患病原菌［1］，可引起人和動物的各種疾病，如人類發(fā)熱、急性腸炎和格林-巴利綜合征［2-3］。在獸醫(yī)學(xué)上，可引起家畜流產(chǎn)、不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎［4］。家畜和野生鳥類是其常見宿主，人類常因為攝入被污染的食物和飲水而感染［5］。而家禽類尤其是雞源產(chǎn)品更是彎曲菌感染傳播的重要途徑［6］。因此，研究彎曲菌具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義［7］。彎曲菌培養(yǎng)條件十分苛刻，25℃不生長，42℃生長較好，微需氧條件，普通培養(yǎng)基上生長不良，生長需要萬古霉素、多黏菌素B等抗菌藥物的血瓊脂培養(yǎng)基［8-9］。而常規(guī)生化鑒定則耗時費力，過程復(fù)雜。本試驗優(yōu)化了彎曲菌的分離培養(yǎng)過程，以利于后續(xù)檢測工作的進(jìn)行，并建立空腸彎曲菌的PCR檢測鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33560由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實驗室提供，大腸埃希菌ATCC25922購自中國獸藥監(jiān)察所，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 彎曲菌CCDA瓊脂、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)為英國OXOID公司產(chǎn)品；綿羊全血為青島海博生物科技公司產(chǎn)品；TTC瓊脂為北京陸橋生物科技公司產(chǎn)品；2×Taq PCR Master Mix、PCR Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；厭氧罐、微需氧產(chǎn)氣袋為日本MGC公司產(chǎn)品；常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 樣本采集 采集青島地區(qū)雞盲腸包裝，低溫條件下運送至實驗室。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 用接種環(huán)沾取少量雞盲腸內(nèi)容物，劃線接種到CCDA選擇性培養(yǎng)基上，置于微需氧培養(yǎng)罐內(nèi)，42℃培養(yǎng)48h。進(jìn)行2次傳代培養(yǎng)，選取可疑菌落接種于TTC瓊脂平板培養(yǎng)，陽性者為紫色菌苔并有光澤，挑取單菌落接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 菌株API鑒定 挑選出氧化酶陽性的菌株，用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上選取純培養(yǎng)物，制成6麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，根?jù)彎曲菌API鑒定條（API20800）說明進(jìn)行操作接種并培養(yǎng)，判讀培養(yǎng)結(jié)果，查閱API20800鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株鑒定。

1.2.3 PCR方法的建立

1.2.3.1 PCR引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表和Nielsen等［10-12］報道的序列，針對空腸彎曲菌16 S rRNA基因設(shè)計引物，上游引物為5′-CATCTTCCCTAGTCAAGCCT-3′，下游引物為5′-AAGATATGGCACTAGCAAGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為773bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3.2 模板DNA的提取 用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取適量的純培養(yǎng)物置于盛有1mL PBS的Eppendorf管中，13 500r／min離心5min，去上清。重復(fù)一次離心步驟后，用200μL TE（Tris-EDTA，10∶1）重懸沉淀，放入100℃沸水中煮沸5min～10min。取出置于冰浴中冷卻5min后，13 500r／min離心3min，取上清液作為PCR模板。

1.2.3.3 PCR反應(yīng)體系 模板DNA 2μL，上、下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，2×TaqGreen Mix 12.5μL，滅菌蒸餾水補足至25μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃ 5min；94℃ 1min，64℃ 1min，72℃1min，2個循環(huán)；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 1 min，2個循環(huán)；94℃1min，60℃1min，72℃1min，2個循環(huán)；94℃1min，58℃1min，72℃1min，2個循環(huán)；94℃1min，56℃1min，72℃1min，2個循環(huán)；94℃1min，54℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 10g／L瓊脂糖凝膠按3mg／L加溴化乙錠（EB）制膠。取8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣。用DNA Marker DL 2 000對照。110V電壓，電泳40min，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析電泳結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的測序鑒定，取PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3.5 特異性試驗 用本試驗建立的PCR方法，對分離獲得的空腸彎曲菌以及空腸彎曲菌ATCC、大腸埃希菌ATCC、金黃色葡萄球菌ATCC等對照菌株提取DNA進(jìn)行檢測，從而確定其特異性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

本試驗根據(jù)情況采用彎曲菌CCDA選擇性培養(yǎng)基、TTC瓊脂和哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，彎曲菌在血瓊脂培養(yǎng)基上不溶血，在CCDA選擇性培養(yǎng)基上典型菌落形態(tài)為圓形，光滑，灰色，閃金屬光澤，菌落較小且容易連成串珠狀。TTC瓊脂上成紫色發(fā)亮菌落，單菌落較明顯，易于選取進(jìn)行傳代培養(yǎng)。哥倫比亞血瓊脂上菌落呈淺灰色或黃褐色。

2.2 PCR方法的特異性

選用建立的PCR方法可擴(kuò)增出空腸彎曲菌的特異性片段，而金黃色葡萄球菌ATCC，大腸埃希菌ATCC均不能擴(kuò)增出特異性片段。通過凝膠成像系統(tǒng)對該特異片段進(jìn)行遷移率計算，其大小為773bp，與預(yù)期的片段相符（圖1）。

2.3 方法應(yīng)用

應(yīng)用上述建立的彎曲菌分離培養(yǎng)及PCR方法，我們從100份新鮮雞盲腸樣品中分離出23株空腸彎曲菌，分離率為23%。

2.4 PCR方法的驗證

對PCR鑒定的空腸彎曲菌進(jìn)行API驗證，其鑒定結(jié)果與PCR結(jié)果一致。證明上述空腸彎曲菌PCR方法可應(yīng)用在臨床菌株分離鑒定工作中。

圖1 PCR特異性試驗Fig.1 The specificity test of PCR

3 討論

盲腸內(nèi)容物初代接種在CCDA選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，容易生長出連成串珠狀的菌落，對典型單菌落的選取造成干擾，不利于進(jìn)行傳代培養(yǎng)；而在TTC瓊脂上進(jìn)行生化鑒定，培養(yǎng)后長出的單菌落易于選取，利于純化培養(yǎng)單菌落。結(jié)果表明，經(jīng)過CCDA選擇性培養(yǎng)，TTC瓊脂培養(yǎng)后更容易選取典型單菌落，有利于回歸接種CCDA培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基純化菌株。為保存菌種和PCR鑒定提取模板提供有利條件。

何蕊等［13］應(yīng)用mapA基因和16S基因建立的檢測空腸彎曲菌、彎曲菌的PCR方法，可擴(kuò)增出589bp的特異性片段和857bp的特異性片段，但部分腸道菌擴(kuò)增出非特異性片段；娜仁高娃等［14］根據(jù)空腸彎曲菌hipO基因建立的PCR鑒定方法，并非所有空腸彎曲菌都能擴(kuò)增出149bp特異性片段。本試驗所建立的PCR方法有較強特異性，結(jié)果顯示，空腸彎曲菌擴(kuò)增出特異性條帶，而其他參考菌株均未擴(kuò)增出條帶，說明該方法有較強特異性。

綜上所述，經(jīng)過優(yōu)化的分離培養(yǎng)有利于純化菌株，更有利于PCR鑒定檢測及菌種的長期保存。

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