熊東升，呂顏枝，2，代盈盈，王文麗，趙慧英＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221006）

雌激素是下丘腦－垂體－性腺軸中影響動(dòng)物生殖活動(dòng)的重要激素之一，其主要通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）調(diào)節(jié)靶細(xì)胞，ER 包括 ERα和ERβ兩種經(jīng)典亞型。腺垂體通過分泌多種激素如催乳素（prolactin，PRL）和促性腺激素（包括促卵泡素（follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）等調(diào)節(jié)機(jī)體生殖相關(guān)內(nèi)分泌活動(dòng)，雌激素對(duì)這些激素的分泌具有反饋調(diào)節(jié)作用。有研究表明［1－2］，妊娠大鼠腺垂體中有大量ER陽性細(xì)胞，其表達(dá)量隨著妊娠進(jìn)行而增加；RTPCR定量分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠中期ERαm RNA表達(dá)有一個(gè)顯著的高峰，但ERα蛋白水平表達(dá)恒定，ERβ在妊娠期的表達(dá)沒有發(fā)生變化，與雌激素的水平不相關(guān)。雌激素可通過ER的介導(dǎo)來調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素（Gn RH）的刺激作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)FSH和LH的分泌；另外，雌激素還促進(jìn)PRL的合成、儲(chǔ)存和釋放，為產(chǎn)后泌乳做好準(zhǔn)備［3－4］。朱雨嵐等［5］用雙標(biāo)記的方法對(duì)人類多激素型垂體腺瘤的研究中證明了ER在垂體的PRL、FSH和LH分泌細(xì)胞中表達(dá)。但目前對(duì)于妊娠期山羊腺垂體中ERα和ERβ與激素分泌細(xì)胞的共存研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)用免疫組化雙標(biāo)記法對(duì)腺垂體中ERα和ERβ與PRL、FSH和LH的共表達(dá)進(jìn)行研究，為闡明妊娠期山羊的生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 妊娠前期（1 d～30 d）、中期（31 d～120 d）、后期（121 d～150 d）山羊各5只，購自楊凌農(nóng)戶。

1.1.2 主要試劑和儀器 抗兔免疫組織化學(xué)Max－Vision超敏試劑盒、兔抗羊PRL多克隆抗體、棕色DAB染色試劑盒，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；兔抗羊（ERα、ERβ、FSH、LH）多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)開發(fā)有限公司；藍(lán)色DAB顯色劑、葡萄糖過氧化物酶，購自美國SIGMA公司；德國Leica石蠟切片機(jī)；Motic顯微照相機(jī)；江蘇捷達(dá)科技形態(tài)學(xué)分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 取材及材料處理 山羊經(jīng)放血致死后迅速取下羊頭，先用37℃的生理鹽水向兩側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)注入400 mL～500 mL沖去殘血，隨后灌注等量4℃的40 g／L多聚甲醛固定液。開顱取出垂體后固定24 h。固定后自來水沖洗24 h，再酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋，最后做石蠟連續(xù)切片（6μm）。

1.2.2 免疫組織化雙標(biāo)記法染色法程序 切片經(jīng)脫蠟復(fù)水和抗原修復(fù)后做雙標(biāo)染色：①滴加30 mL／L過氧化氫，室溫10 min；②滴加ERα和ERβ多克隆抗體之一（1∶200）室溫下孵育60 min；③滴加Max Vision試劑室溫下孵育10 min～15 min；棕色DAB呈色；④25 g／L高錳酸鉀－50 mL／L硫酸洗脫液洗脫5 min，滅活ER剩余抗體活性，再用5 g／L焦亞硫酸鈉還原30 s。⑤滴加第二種一抗PRL、FSH 和LH 之一（1∶200）室溫下孵育60 min；⑥滴加Max Vision試劑室溫下孵育10 min～15 min；藍(lán)色DAB呈色，以上各步之間均用0.01 mol／L PBS緩沖液沖洗。最后常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照試驗(yàn)用0.01 mol／L PBS代替兩種一抗，其他步驟相同。最后觀察結(jié)果，顯微照相及用江蘇捷達(dá)科技形態(tài)學(xué)分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化雙標(biāo)染色的結(jié)果

經(jīng)免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法染色的切片，ERα或ERβ免疫陽性產(chǎn)物為棕褐色；PRL、FSH和LH免疫陽性產(chǎn)物為藍(lán)色；雙標(biāo)記則為棕黑色。

2.1.1 妊娠各期ERα與3種激素的共存 在妊娠前期ERα與PRL共同著色的細(xì)胞數(shù)量較少，多呈橢圓形，ERα多存在于PRL細(xì)胞的胞質(zhì)中，胞核中少見著雙色，背景呈淺藍(lán)色（圖1A1）；妊娠中后期著藍(lán)色較深的PRL陽性細(xì)胞較多，著棕色的ERα陽性細(xì)胞散在于PRL陽性細(xì)胞之間，僅少量的雙著色細(xì)胞膜（圖1A2、圖1A3）。妊娠前期ERα與FSH共同著色的細(xì)胞數(shù)量較多，多數(shù)存在于血竇周圍呈橢圓形或多邊形，胞質(zhì)重合著色較深，其他區(qū)域細(xì)胞可見胞膜著雙色，背景呈淺棕色，妊娠前期和中期ERα和FSH共存于腺垂體細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中（圖1B1、圖1B2）；后期多在胞質(zhì)中共存（圖1B3）；妊娠前期和中期ERα與LH共同著色位置在細(xì)胞的胞質(zhì)中（圖1 C1、圖1C2）；妊娠后期可見胞膜著雙色，還可見著棕色的ERα顆粒（圖1C3）。

圖1 山羊妊娠各期ERα和與PRL、FSH和LH在垂體中的免疫組化雙標(biāo)染色（400×）Fig.1 The immunohistochemical double labeled stain of ERαwith PRL，F(xiàn)SH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.1.2 妊娠各期ERβ與3種激素的共存 ERβ和PRL的共存的細(xì)胞個(gè)體較小呈胞質(zhì)深著色，夾雜在淺藍(lán)色的PRL陽性細(xì)胞之間，數(shù)量在整個(gè)妊娠過程中有逐漸增多的現(xiàn)象，ERβ多數(shù)存在于PRL細(xì)胞的胞質(zhì)中，少數(shù)存在于胞核中（圖2A1、A2、A3）。妊娠過程中ERβ與FSH的共同著色細(xì)胞多為腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部的嗜堿粒細(xì)胞，形狀與ERα和FSH共存的細(xì)胞相似，陽性物質(zhì)多存在于胞質(zhì)和胞核，未見有胞膜著色的，數(shù)量也呈減少趨勢(shì)（圖2B1、B2、B3）。在妊娠后期有個(gè)別全細(xì)胞著色（圖2 B3）。妊娠前期和中期ERβ與LH的共同著色細(xì)胞為腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部的嗜堿粒細(xì)胞，陽性物質(zhì)呈多邊形（圖2C1、C2），數(shù)量隨妊娠的進(jìn)行逐漸增多。在妊娠后期陽性細(xì)胞在胞質(zhì)和核膜均有ERβ和LH的共存，未見核著色（圖2C3）。

圖2 山羊妊娠各期ERβ與PRL、FSH和LH在垂體中的免疫組化雙標(biāo)染色（400×）Fig.2 The immunohistochemical double labeled stain of ERβwith PRL，F(xiàn)SH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.2 妊娠各期ER與腺垂體中3種激素共存細(xì)胞的數(shù)量

免疫組化雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，ERα和ERβ分別與PRL、FSH和LH共存的陽性細(xì)胞數(shù)量有一定變化趨勢(shì)，表現(xiàn)為ERα和ERβ分別與PRL和LH共存的陽性細(xì)胞的數(shù)量隨妊娠進(jìn)行逐漸增加；與FSH共存的陽性細(xì)胞數(shù)量則逐漸減少（表1）。

表1 妊娠期腺垂體中陽性細(xì)胞的數(shù)量Table1 The number of positive cells in adenohypophysis during pregnancy

3 討 論

Gonza M等［6］研究大鼠垂體中ER兩種亞型的分布，發(fā)現(xiàn)在大鼠整個(gè)發(fā)情期，ERα陽性產(chǎn)物均多數(shù)分布于PRL細(xì)胞，少數(shù)分布于FSH細(xì)胞，ERβ陽性產(chǎn)物僅有少數(shù)分布于PRL和FSH細(xì)胞；ERα的陽性產(chǎn)物存在于胞質(zhì)及胞核，且與發(fā)情周期有關(guān)，ERβ的陽性產(chǎn)物多存在于胞質(zhì)。本試驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色顯示，妊娠期山羊腺垂體ERα和ERβ均與PRL、FSH和LH有共存，主要共存于胞質(zhì)中，也有少數(shù)在胞膜或胞核中共存，并隨著妊娠的進(jìn)行在細(xì)胞中分布位置發(fā)生變化。說明不同的動(dòng)物不同的生理時(shí)期ERα和ERβ在細(xì)胞中的分布位置和存在細(xì)胞的類型也不一樣。對(duì)綿羊垂體中ER的研究表明［7］，妊娠145 d后綿羊垂體中ERα蛋白的表達(dá)較之前有很大的升高，但ERβ蛋白的表達(dá)與妊娠后80 d和120 d相比則是減少。研究表明［8］，ER在分泌PRL和PRL細(xì)胞增生方面起重要作用，ER基因敲除小鼠PRL mRNA表達(dá)明顯減少，PRL細(xì)胞數(shù)減少，而LH和FSH 細(xì)胞表達(dá)增加［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明ER與PRL和LH共存陽性細(xì)胞的數(shù)量表現(xiàn)為隨妊娠的進(jìn)行逐漸增加，與FSH的共存則相反，與該研究結(jié)構(gòu)一致。胞漿內(nèi)的ER具有運(yùn)載雌激素的作用，胞核內(nèi)的ER具有轉(zhuǎn)錄因子的作用［10－11］，兩種ER亞型均可以介導(dǎo)雌激素的作用［12－13］，表明在妊娠期雌激素可能通過ERα和ERβ來作用于PRL、FSH和LH的分泌，但是以ERα對(duì)PRL和FSH的分泌調(diào)控為主，推測(cè)其主要目的是為產(chǎn)后泌乳做準(zhǔn)備。

［1］楊永倩.ER和ICAM－1在妊娠早期和流產(chǎn)大鼠下丘腦、垂體、卵巢和子宮中的表達(dá)［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

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