余彬輝，王斌卿，胡志航，朱炳林，李肖梁，方維煥

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江杭州310018）

當(dāng)今病毒性疫苗多利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，生產(chǎn)工藝不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且占用空間大，更重要的是病毒滴度不穩(wěn)定，批次之間病毒效價(jià)差異大。隨著疫苗市場的迅速發(fā)展，其生產(chǎn)技術(shù)將經(jīng)歷一場深刻的技術(shù)革新，從轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)向生物反應(yīng)器培養(yǎng)轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變符合世界生物制藥發(fā)展趨勢，也表明我國疫苗生產(chǎn)技術(shù)將逐步與國際疫苗生產(chǎn)技術(shù)接軌。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用［1］。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和表達(dá)對生產(chǎn)疫苗有明顯的優(yōu)勢，一方面活性高、穩(wěn)定性好，是最重要的表達(dá)系統(tǒng)，但動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗還存在一定問題［2－3］，培養(yǎng)密度和產(chǎn)物濃度較低，在技術(shù)和設(shè)備上遠(yuǎn)沒有原核細(xì)胞培養(yǎng)成熟。

目前用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有很多種，但各具優(yōu)缺點(diǎn)［4－5］。如常見的攪拌式生物反應(yīng)器，雖然混合傳氣效果較好、細(xì)胞培養(yǎng)密度高，但高的剪切力產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片影響產(chǎn)物質(zhì)量，而且給分離帶來一定困難［6］；激流灌注式生物反應(yīng)器是一種新型簡便的生物反應(yīng)器［7］，可用于貼壁和懸浮兩種模式的細(xì)胞培養(yǎng)。該反應(yīng)器采用一次性塑料耗材，灌注培養(yǎng)系統(tǒng)采用外循環(huán)式細(xì)胞載體灌注培養(yǎng)工藝，將裝有紙片載體的培養(yǎng)袋（即灌注系統(tǒng)）固定于反應(yīng)器外，動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長于紙片載體上，通過蠕動(dòng)泵及重力作用打入培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)激流系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)的循環(huán)，培養(yǎng)液供給細(xì)胞正常生長代謝所需的養(yǎng)分，帶走代謝產(chǎn)物；利用激流式生物反應(yīng)器拖帶式傳氣技術(shù)在線監(jiān)控溶氧、p H、溫度等培養(yǎng)條件，為細(xì)胞生長創(chuàng)造有利的環(huán)境，同時(shí)此部分也可單獨(dú)進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

本試驗(yàn)應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，通過對培養(yǎng)基、細(xì)胞接種密度、耗糖量、溶氧量、p H和溫度等參數(shù)的優(yōu)化，建立MDCK細(xì)胞生物反應(yīng)器規(guī)?；瘮U(kuò)繁技術(shù)，為獲得高密度細(xì)胞及在病毒疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑 MDCK細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫上海生命科學(xué)院產(chǎn)品；MEM、DMEM、DMEM／F12培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；胰酶，上海澤衡生物公司產(chǎn)品；葡萄糖測定試劑盒，為上海史瑞克生物公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 分光光度計(jì)、高效液相色譜儀、倒置顯微鏡、AP10 4L生物反應(yīng)器、溶氧電極、p H計(jì)、細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中取出1管MDCK細(xì)胞于37℃快速解凍后，加到含100 mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4 h換液。待長成單層后PBS清洗1次，胰酶消化后以1∶4～1∶5的比率傳代擴(kuò)繁。

1.2.1.2 轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 加適量MDCK細(xì)胞和紙片載體于轉(zhuǎn)管中（40 mL培養(yǎng)體系），采用間歇換液法培養(yǎng)，48 h后每12 h半數(shù)換液。

1.2.1.3 激流生物反應(yīng)器培養(yǎng)

1.2.1.3.1 準(zhǔn)備工作 將激流袋和灌注袋充氣后檢漏，氣密性完好的情況下將PBS注入灌注袋浸泡紙片載體。將p H、溫度和溶氧電極分別校準(zhǔn)后裝入盛有PBS緩沖液的不銹鋼桶中121℃高壓滅菌30 min。

1.2.1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 安裝好反應(yīng)器和電極后，在AP10反應(yīng)器中加4 L DMEM－HG。設(shè)定條件：紙片載體100 g，p H 7.2、溶氧量（DO）50%～60%，37℃、循環(huán)速度400 mL／min、振蕩頻率60 r／min，接入1.5×106個(gè)／mL MDCK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)條件處理 按培養(yǎng)基種類、p H、接種密度、DO值等參數(shù)對細(xì)胞生長的影響進(jìn)行以下不同處理。

1.2.2.1 培養(yǎng)基 在紙片載體0.6 g、細(xì)胞接種密度2.5×105個(gè)／mL培養(yǎng)體系為40 mL等固定條件下，分析不同培養(yǎng)基（MEM、DMEM／F12、DMEMHG或DMEM－LG）對細(xì)胞生長的影響。

1.2.2.2 p H 在紙片載體0.6 g、37℃，細(xì)胞接種密度2.5×105個(gè)／mL固定條件下，分析不同p H（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）對細(xì)胞生長的影響。

1.2.2.3 細(xì)胞接種密度 在紙片載體 0.6 g、DMEM－HG培養(yǎng)基、p H 為7.2、37℃，40 mL培養(yǎng)體系的條件下，細(xì)胞接種密度分別為1.25×105、2.50×105、3.75×105、5.0×105、7.5×105個(gè)／mL時(shí)的生長狀況。

1.2.2.4 溶氧量 紙片載體100 g、細(xì)胞接種密度1.5×106個(gè)／mL、搖床速度60 r／min、流量400 mL／min、p H7.2、37℃等固定條件下，DO分別設(shè)為20%～40%、50%～60%、70%～80%對細(xì)胞生長的影響。

1.2.2.5 液體流量和震蕩頻率 載紙片體100 g、細(xì)胞接種密度（1.5×106個(gè)／mL）、DO（50%～60%）、p H7.2和溫度（37℃）等固定條件下，不同液體流量（200、300、400、500 mL／min）和不同振蕩頻率（40、60、80 r／min）培養(yǎng)對細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3 細(xì)胞生長分析 將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS清洗2遍后，加入含1 g／L結(jié)晶紫的檸檬酸溶液1 L于37℃溫室放置40 min揉搓搖勻后取樣計(jì)數(shù)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度。

1.2.4 細(xì)胞代謝分析

1.2.4.1 葡萄糖測定 按照葡萄糖測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4.2 氨基酸測定 按照氨基酸測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4.3 紙片貼壁率計(jì)算

貼壁率（%）＝X1／X0×100%

X0代表接種時(shí)的細(xì)胞量，X1代表3h后紙片載體上的細(xì)胞貼壁數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對MDCK細(xì)胞生長和代謝的影響

DMEM－HG培養(yǎng)MDCK細(xì)胞5 d，細(xì)胞密度達(dá)到最高（3.2×106個(gè)／mL，圖1A）；采用DMEM－HG培養(yǎng)基，利用間歇換液法培養(yǎng)第6天細(xì)胞密度達(dá)到最高（3.46×106個(gè)／mL，圖1B）。

圖1 不同培養(yǎng)基對MDCK細(xì)胞生長和比生長速率的影響Fig.1 Effects of different media on cell density and specific growth rates in MDCK cells

2.2 細(xì)胞接種密度對MDCK細(xì)胞生長和代謝的影響

在載體量0.6 g、間歇換液法培養(yǎng)5 d的條件培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，結(jié)果表明接種密度越大糖耗越高；同時(shí)糖耗高峰期也隨細(xì)胞量的增大而提前，但細(xì)胞產(chǎn)量卻不和接種密度成正比（表1）。

表1 接種密度對MDCK細(xì)胞生長的影響Table1 Effect of cell density on MDCK cell growth

2.3 p H對MDCK細(xì)胞生長的影響

圖2表明，MDCK細(xì)胞在p H7.2時(shí)細(xì)胞密度最高（1.04×107個(gè)／mL），因此7.2為最適p H。

圖2 p H對MDCK細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effect of p H on MDCK cell growth

2.4 DO值、循環(huán)流量及振蕩頻率對MDCK細(xì)胞生長和代謝的影響

在相同條件（接種密度1.5×106個(gè)／mL、p H 7.2、37℃、培養(yǎng)6 d，分別固定DO值、循環(huán)流量和振蕩頻率進(jìn)行反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)化試驗(yàn)。從圖3看出，DO值50%～60%，循環(huán)流量400 mL／min和振蕩頻率60 r／min條件下可收獲最大量細(xì)胞（17.8×106、16.4×106、18.6×106個(gè)／mL）。

2.5 激流生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞

圖4表明細(xì)胞在第5天達(dá)到最高耗糖量（3.1 g／L）和最高細(xì)胞密度（1.02×107個(gè)／mL）；第2天達(dá)到最大比生長速率。整個(gè)培養(yǎng)過程中利用氣體流通開放式進(jìn)行培養(yǎng)，因此氨濃度為零。從圖4B看出，乳酸的最大濃度為28.1 mmo L／L，而氨基酸從第4天以后為零，因此在生產(chǎn)中根據(jù)需要補(bǔ)充氨基酸。

圖3 DO、循環(huán)流量和振蕩頻率對細(xì)胞生長的影響Fig.3 Effects of DO，circulation flow and oscillation rate on cell growth

3 討論

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝是目前成熟的疫苗培養(yǎng)方法，但由于操作繁瑣，傳代環(huán)節(jié)多，易污染及產(chǎn)品質(zhì)量難于控制是其大規(guī)模應(yīng)用的主要障礙。激流式生物反應(yīng)器采用紙片載體培養(yǎng)模式，紙片載體呈三維立體結(jié)構(gòu)，可增加細(xì)胞黏附生長面積。該模式易于細(xì)胞生長及營養(yǎng)供給，培養(yǎng)過程可采用連續(xù)灌注培養(yǎng)，不斷加入新鮮培養(yǎng)液的同時(shí)排出舊液，能有效供給營養(yǎng)除去代謝產(chǎn)物，使細(xì)胞始終處于良好的營養(yǎng)狀態(tài)，適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)延長細(xì)胞維持時(shí)間，有利于病毒的持續(xù)繁殖，提高疫苗產(chǎn)量［8－10］。

MDCK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要消耗大量的糖，在糖耗完后就利用氨基酸作為碳源［11］。D／F12、MEM和DMEM－LG培養(yǎng)基中葡萄糖在第3天便耗完，而 DMEM－HG 在第5天 才 耗 完，因 此DMEM－HG最適于 MDCK細(xì)胞生長。代謝過程中，氨離子濃度很低，但乳酸的產(chǎn)量較高，因此培養(yǎng)到48 h進(jìn)行全換液。每24 h取樣檢測耗糖量，根據(jù)檢測情況及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖和氨基酸。

本試驗(yàn)采用48 h后每12 h半數(shù)換液的方式，消除代謝產(chǎn)物給細(xì)胞帶來的不利影響［11－12］。單純從細(xì)胞培養(yǎng)密度出發(fā)，換液培養(yǎng)要比不換液高2倍，同時(shí)細(xì)胞生長對數(shù)周期短、倍增時(shí)間快，利于細(xì)胞保持良好狀態(tài)，便于提前接種病毒。激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，在細(xì)胞密度、擴(kuò)增倍數(shù)、比生長速率等方面都明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，此外它能減少污染、節(jié)約空間和人力［13］。激流式生物反應(yīng)器是靠激流供氧，因此是機(jī)械剪切力小、混合性能好的新型供氧培養(yǎng)系統(tǒng)［14］。另外，激流式反應(yīng)器附有呼吸袋，因此細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氨等不利氣體通過呼吸袋排出培養(yǎng)系統(tǒng)。

圖4 激流生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞Fig.4 Cultivating MDCK cells in AP10 4L bioreactor

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