陳 浩, 石 屹 峰

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

碳青霉烯類抗生素是自1976年發(fā)現(xiàn)并逐步發(fā)展起來的一組新型的β-內(nèi)酰胺類抗生素,其抗菌譜廣,對絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌與陰性菌、需氧菌與厭氧菌均具有良好的抗菌作用?，F(xiàn)今應用于臨床的主要品種有亞胺培南、美羅培南等。碳青霉烯類對細菌產(chǎn)生的各類β-內(nèi)酰胺酶都很穩(wěn)定,但是金屬β-內(nèi)酰胺酶對碳青霉烯類耐藥[1]。金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo β-Lactamases, MBLs)是一類活性依賴二價金屬陽離子(主要是Zn(Ⅱ))的β-內(nèi)酰胺酶,根據(jù)Ambler等對β-內(nèi)酰胺酶分子結構分類,MBLs屬于B類。該類酶除了能夠有效地水解大部分的β-內(nèi)酰胺類抗生素,還能夠水解抗菌譜廣的碳青霉烯類抗生素,并且常用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等)對其無作用。絕大多數(shù)獲得性MBLs基因位于整合子等可移動的基因元件,可通過結合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等發(fā)生轉(zhuǎn)移,并且整合子通常攜帶有臨床重要的抗性基因,這就造成了MBLs的廣泛耐藥,成為臨床治療細菌性感染疾病的一個重大難題。自1990年以來,MBLs在世界范圍內(nèi)被廣泛發(fā)現(xiàn),主要是IMP、VIM型,還包括SPM、GIM和SIM等多種類型。其中VIM型起初來源于銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa,迄今為止已發(fā)現(xiàn)19種[2],它的活性依賴于2個Zn(Ⅱ)。VIM型不僅能夠水解青霉素類和頭孢霉素類抗生素,而且能夠水解碳青霉烯類抗生素,臨床常用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對VIM型也不起任何抑制作用,因此攜帶MBLs的耐藥菌被視為人類面臨的緊迫的傳染和生物安全問題。作者以VIM型為例,通過使用生物信息學方法的系統(tǒng)研究,找出影響碳青霉烯類抗生素水解催化作用的關鍵殘基,以期為將來合理設計金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶的序列及結構

以VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)為研究對象,其氨基酸序列來源于NCBI protein數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),結構從PDB數(shù)據(jù)庫搜索得到。

1.2 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶結構與功能研究

利用clustalw軟件對VIM型MBLs氨基酸序列(14種VIM型序列來源列于表1)進行序列比對及同源性分析,找出突變位點,在MEGA3.1軟件中生成最終的比對結果并構建系統(tǒng)進化樹。使用Pymol軟件對蛋白質(zhì)結構進行觀察和分析,并結合動力學數(shù)據(jù)確定催化功能的關鍵殘基。

表1 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列NCBI編號及宿主和地區(qū)來源

2 結果和討論

2.1 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶結構和催化機制

所有的MBLs都具有αββα折疊結構,以β折疊為核心,α螺旋環(huán)繞在β折疊的周圍,活性中心位于兩個αβ結構域中間,并依賴金屬離子的存在而發(fā)揮其活性作用。VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶同樣也具有αββα折疊結構,從VIM-2的晶體結構(圖1)可以看出該蛋白質(zhì)結構兩半是相似的αβ結構域,該酶必需的Zn(Ⅱ)輔助因子所在的活性中心位于2個αβ結構域交界處淺溝中[14]。

影響碳青霉烯類水解的關鍵殘基的位置由黑點標出,L3和L1環(huán)區(qū)所在的位置如所指。

VIM型是雙鋅原子型MBLs以兩個Zn(Ⅱ)作為輔助因子, Zn1與3個His (His116、His118、His196)及1個水分子(與Zn2共用)形成了一個暫時的四面體結構,在催化過程中Zn1與Asn233的側鏈形成一個氧負離子洞,穩(wěn)定了該反應的反應中間體, Zn2與Asp120、Cys221、His263結合。兩個Zn(Ⅱ)與共用的水分子結合后形成親核試劑攻擊β-內(nèi)酰胺環(huán)的羰基,使β--內(nèi)酰胺環(huán)的C—N鍵裂解,β-內(nèi)酰胺類抗生素水解失效[15]。

圖1 VIM-2型金屬β-內(nèi)酰胺酶結構(PDB 1KO3)

2.2 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶序列比對

在酶分子的進化過程當中,一些功能上起重要作用的殘基在不同種類但是同源的蛋白質(zhì)中表現(xiàn)出高度的保守性,這些序列可以很容易地通過多序列比對的方法找到。根據(jù)已知的VIM-2晶體結構找出活性中心兩個Zn(Ⅱ)結合的配基共有6個 (圖1)。根據(jù)氨基酸序列比對結果(圖2)可以看出,其他13種VIM型活性中心與Zn1和Zn2結合的這6個作為配基氨基酸的位點是高度保守的。由于所有VIM型Asn233的側鏈參與形成氧負離子洞[16],所以Asn233也是保守的(圖2)。另外,在60～66號位有一個重要的環(huán)區(qū)——L1[16],在S11與H4之間220～240號位還有一個很重要的環(huán)區(qū)——L3[17](圖1),這兩個環(huán)區(qū)鄰近酶活性中心所在的位置, 影響MBLs對底物的水解。

黑框,活性中心保守序列；*,發(fā)生替換的關鍵殘基；上方標注數(shù)字,BBL序列編號； H,α螺旋；S,β折疊；L,環(huán)區(qū)

2.3 VIM金屬β-內(nèi)酰胺酶催化碳青霉烯類抗生素水解關鍵殘基

表2列出了已發(fā)表的VIM-1、VIM-2、VIM-7、VIM-19、VIM-11的碳青霉烯類的酶動力學參數(shù)?？梢钥闯?VIM-2表現(xiàn)出對碳青霉烯類很高的水解效率,水解美羅培南和亞胺培南的kcat/Km分別是VIM-1的10倍和30倍。VIM-2的大部分與VIM-1不同的位點(35,148,215,246,251,257,258,284,287,294,299)都位于遠離活性中心的位置,但是有3個殘基(223,224,228)的替換在L3環(huán)區(qū)上(圖2)。由于 L3環(huán)區(qū)鄰近酶活性中心所在的位置,這3個殘基的替換可能影響底物與酶的結合[17]。VIM-1的224號位是His,而在VIM-2中則是Tyr,它的側鏈變長對底物的結合和穩(wěn)定性有利。VIM-1的228號位是Ser,而VIM-2中則是Arg,其側鏈變長伸進活性中心可與底物發(fā)生相互作用。所以對于碳青霉烯類酶動力學參數(shù)的不同很可能是由于VIM-2在224號位和228號位發(fā)生的替換導致增強了對底物的相互作用所引起的。

表2 碳青霉烯類酶動力學參數(shù)

VIM-7對碳青霉烯類的水解效率同樣高于VIM-1。VIM-7在224號位和228號位發(fā)生了與VIM-2相同的替換:His224Tyr,Ser228Arg。Pro68Ser和Tyr218Phe這兩個位點的替換僅僅發(fā)生在VIM-7中,Pro68是金屬β-內(nèi)酰胺酶中的較為保守的殘基,通過與His263(Zn2的配基)在主鏈上羰基化氧形成氫鍵。盡管此殘基被Ser所取代,可能增加了L1的柔性,但仍能形成氫鍵[16],不降低對碳青霉烯類的水解。

VIM-11表現(xiàn)出與VIM-2基本相同的水解效率,VIM-11 在223、224、228殘基位置發(fā)生了與VIM-2相同的替換。

VIM-19對碳青霉烯類的水解效率依然高于VIM-1。VIM-1與VIM-19之間僅有兩個位點不同:Asn215Lys和Ser228Arg。Asn215Lys位于遠離活性中心的位置, Arg228可導致VIM-19對碳青霉烯類水解效率提高[2]。與VIM-1相比,這個殘基的替換與VIM-2、VIM-7、VIM-11中相同。

2.4 VIM型進化樹

在VIM型MBLs中VIM-1、VIM-2、VIM-7的基因發(fā)現(xiàn)的頻率最高[9]。根據(jù)現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的14種VIM型MBLs序列比對結果生成進化樹。根據(jù)進化樹VIM型被分為3組:VIM-1組包括VIM-4、VIM-5、VIM-19等；VIM-2組包括VIM-3、VIM-6、VIM-8、VIM-9、VIM-10、VIM-11等[19],它們與VIM-1在序列上有高達90%的同源性。VIM-7單獨分為一組[19],由于它與其他VIM型的酶有顯著的不同,VIM-7與VIM-1氨基酸序列同源性只有77%(圖3)。

圖3 VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶進化樹

3 結 論

通過對VIM型MBLs氨基酸序列比對并且結合動力學參數(shù)分析其結構和功能的關系,確定了結合兩個Zn(Ⅱ)發(fā)揮催化作用的保守殘基分別是His116、His118、His196和Asp120、Cys221、His263,以及形成氧負離子洞的Asn233,還發(fā)現(xiàn)了L3環(huán)區(qū)上殘基改變會影響碳青霉烯類的水解。通過找出影響VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶對碳青霉烯類抗生素水解的這些關鍵殘基,為將來合理設計金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑奠定基礎。

[1] QUEENAN A M, BUSH K. Carbapenemases:the versatile β-lactamases[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2007, 20(3):440-458.

[2] RODRIGUEZ-MARTINEZ J M, NORDMANN P, FORTINEAU N, et al. VIM-19, a metallo-β-lactamase with increased carbapenemase activity fromEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniae[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, 54(1):471-476.

[3] CARATTOLI A, ASCHBACHER R, MARCH A, et al. Complete nucleotide sequence of the IncN plasmid pKOX105 encoding VIM-1, QnrS1 and SHV-12 proteins inEnterobacteriaceaefrom Bolzano, Italy compared with IncN plasmids encoding KPC enzymes in the USA[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, 65(10):2070-2075.

[4] POIREL L, NAAS T, NICOLAS D, et al. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-β-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from aPseudomonasaeruginosaclinical isolate in France[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44(4):891-897.

[5] YAN J, HSUEH P, KO W, et al. Metallo-β-Lactamases in clinicalPseudomonasisolates in Taiwan and identification of VIM-3, a novel variant of the VIM-2 enzyme[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45(8):2224-2228.

[6] LIBISCH B, MUZSLAY M, GACS M, et al. Molecular epidemiology of VIM-4 metallo-beta-lactamase-producingPseudomonassp. isolates in Hungary[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50 (12):4220-4223.

[7] BAHAR G, MAZZARIOL A, KONCAN R. et al. Detection of VIM-5 metallo-beta-lactamase in aPseudomonasaeruginosaclinical isolate from Turkey[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 54(1):282-283.

[8] CASTANHEIRA M, BELL J M, TURNIDGE J D, et al. Dissemination and genetic context analysis of bla(VIM-6) amongPseudomonasaeruginosaisolates in Asian-Pacific Nations[J]. Clinical Microbiology and Infection, 2010, 16(2):186-189.

[9] SAMUELSEN Φ, CASTANHEIRA M, WALSH T R, et al. Kinetic characterization of VIM-7, a divergent member of the VIM metallo-β-lactamase family[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52(8):2905-2908.

[10] CRESPO M P, WOODFORD N, SINCLAIR A, et al. Outbreak of carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosaproducing VIM-8, a novel metallo-beta-lactamase, in a tertiary care center in Cali, Colombia[J]. Joural of Clinical Microbiology, 2004, 42(11):5094-5101.

[11] PASTERAN F, FACCONE D, PETRONI A, et al. Novel variant blaVIM-11of the metallo-β-lactamase blaVIMfamily in a GES-1 extended-spectrum-β-lactamase-producingPseudomonasaeruginosaclinical isolate in Argentina[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(1):474-475.

[12] IKONOMIDIS A, LABROU M, AFKOU Z, et al. First occurrence of anEscherichiacoliclinical isolate producing the VIM-1/VIM-2 hybrid metallo-β-lactamase VIM-12[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(8):3038-3039.

[13] JUAN C, BECEIRO A, GUTIERREZ O, et al. Characterization of the new metallo-β-lactamase VIM-13 and its integron-borne gene from aPseudomonasaeruginosaclinical isolate in Spain[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52(10):3589-3596.

[14] CROWDER M W, SPENCER J, VILA A J.Metallo-β-lactamases:novel weaponry for antibiotic resistance in bacteria[J]. Accounts of Chemical Research, 2006, 39(10):721-728.

[15] PAGE M I. Understanding metallo β-lactamases[J]. ASM News, 2002, 68(5):217-221.

[16] MOALI C, ANNE C, LAMOTTE-BRASSEUR J, et al. Analysis of the importance of the metallo-β-lactamase active site loop in substrate binding and catalysis[J]. Chemistry & Biology, 2003, 10:319-329.

[17] DOCQUIER J D, LAMOTTE-BRASSEUR J, GALLENI M, et al. On functional and structural heterogeneity of VIM-type metallo-β-lactamases[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 51:257-266.

[18] MARCHIARO P, TOMATIS P E, MUSSI M A, et al. Biochemical characterization of metallo-β-lactamase VIM-11 from aPseudomonasaeruginosaclinical strain[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52(6):2250-2252.

[19] POURNARAS S, IKONOMIDIS A, TZOUVELEKIS L S, et al. VIM-12, a novel plasmid-mediated metallo-β-lactamase fromKlebsiellapneumoniaethat resembles aVIM-1/VIM-2 hybrid[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(12):5153-5156.