王 紅 英, 孫 井 輝, 錢 斯 日 古 楞, 李 長 青

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

RNA是生物體最重要的基因表的物質(zhì)基礎(chǔ),除了在生物體正常的生長外,它與生命的異常如腫瘤等有密切關(guān)系。雙鏈RNA對基因表達(dá)的阻斷被稱為RNA干預(yù)(RNA interference,RNAi)[1]。雙鏈RNA經(jīng)酶切后會(huì)形成很多小片段,稱為siRNA。它與mRNA中的同源序列互補(bǔ)結(jié)合,會(huì)導(dǎo)致其對應(yīng)的mRNA失去功能,使基因“沉默”,以此治療疾病[2-3]。但siRNA進(jìn)入細(xì)胞后易被降解,故穩(wěn)定和快速傳遞siRNA的新型給藥系統(tǒng)的研究較為關(guān)注[4]。以磁性微球?yàn)檩d體的靶向藥物能夠使藥物靶向傳遞,減輕藥物對其他部位的不良反應(yīng),同時(shí)通過磁場富集的藥物能夠提高療效。因此磁性固定化能夠使siRNA快速到達(dá)目的部位和避免運(yùn)輸過程中的降解。

本研究對啤酒酵母總RNA進(jìn)行提取,并對其進(jìn)行磁性固定化研究,以期為磁性固定化siRNA的靶向性研究和RNAi研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

啤酒酵母(S.cerevisiae)；磁性殼聚糖微球，本實(shí)驗(yàn)室自制[5]；戊二醛,天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 酵母RNA的提取

采用濃鹽法提取酵母RNA[6]。將8 g酵母加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl溶液中,置于100 ℃ 水浴鍋中攪拌4 h,冷卻后在3 500 r/min條件下離心10 min。將上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.4,在冰浴中靜置使其完全沉淀,將所得上清液以3 500 r/min離心10 min獲得核酸沉淀物。用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌沉淀物質(zhì),去除殘余雜質(zhì)及色素；沉淀再用乙醚洗滌兩次,通過布氏漏斗抽濾,冷凍干燥獲得RNA粉末。

1.2.2 定磷法測定啤酒酵母RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用最小二乘法作線性回歸,得回歸方程。

Y=0.047 0X-0.002 7,R2=0.999 6

w(RNA)=10-6n(T1/m1-T2/m)(340/31)

式中,T1,總磷微克數(shù)；T2,無機(jī)磷微克數(shù)；n,稀釋倍數(shù)；m1,樣品數(shù),μg；m,樣品質(zhì)量,μg；340,RNA平均相對分子質(zhì)量；31,磷的原子數(shù)。

1.2.3 磁性微球固定化RNA

準(zhǔn)確稱取10 mg磁性殼聚糖微球,用3%的戊二醛溶液浸泡2 h,對其進(jìn)行活化。再用無水乙醇和超純水對微球反復(fù)洗滌,洗去多余的戊二醛等。將活化好的微球加入到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),在40 ℃條件下振蕩4 h,得到磁性固定化RNA。用磁場將磁性RNA沉淀,用超純水洗滌沉淀至上清液無RNA洗出。匯集上清液,測定RNA總量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母RNA提取的正交優(yōu)化試驗(yàn)

采用正交分析方法對濃鹽法提取酵母RNA提取影響因素進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)為L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)方案見表1。

表1 酵母RNA提取的正交試驗(yàn)因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

水平At/hBθ/℃Cw(NaCl)/%Dw(酵母)/%12908823951010341001212

由表2、3可見,因素A即反應(yīng)時(shí)間為最顯著影響因子。最佳提取工藝為A3B3C2D1,即反應(yīng)時(shí)間4 h,反應(yīng)溫度100 ℃,氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，最佳提取條件下RNA的提取率可達(dá)6.13%。

表2 酵母RNA提取的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

試驗(yàn)號ABCD提取率/%111114.70212225.52313336.00421234.82522315.59623126.01731324.88832135.45933216.13均值15.4074.8005.3875.473均值25.4735.5205.4905.470均值35.4876.0475.4905.423極差0.0801.2470.1030.050

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性抽提時(shí)間2.3502111.90519.000*抽提溫度0.02121.00019.000NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01120.52419.000酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.00520.23819.000誤差0.0202

2.2 RNA固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 固定化最佳RNA添加量

取8只100 mL三角瓶,分別加入10 mg經(jīng)活化的磁性微球,再分別加入5、10、15、20、25、30、35和40 mL RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),40 ℃恒溫振蕩4 h,用磁鐵將磁性RNA沉淀,過濾、洗滌、收集上清液,通過定磷法測定總RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,當(dāng)RNA添加量不足30 mL時(shí),固定化后的洗滌上清液中游離的RNA極少,說明少于30 mL 添加量的RNA完全被固定化；當(dāng)RNA添加量超過30 mL時(shí),上清液中的游離RNA量逐漸增大,說明微球表面固定化RNA達(dá)到飽和,繼續(xù)增加RNA添加量,RNA固定化率不變。綜合考慮,每10 mg磁性殼聚糖微球的最佳RNA添加量為30 mL。

2.2.2 固定化最佳反應(yīng)時(shí)間

在4只100 mL三角瓶中各加入10 mg活化的磁性微球和30 mL RNA溶液,40 ℃振蕩2、4、6、8 h。將磁性微球沉淀,過濾,用純水洗滌,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖2所示。由圖2可見,固定化時(shí)間2～8 h,上清液中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)先下降(4 h達(dá)到最低)而后逐漸增大。這是因?yàn)楫?dāng)固定化時(shí)間小于4 h,有部分RNA和微球未很好地結(jié)合；當(dāng)固定化的時(shí)間大于4 h,已被固定化的部分RNA脫落,因而上清液中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加。因此RNA的最佳固定化時(shí)間確定為4 h。

圖1 RNA添加量對磁性固定化的影響

Fig.1 Effect of RNA addition on the magnetic immobilization

圖2 固定化時(shí)間對RNA固定化的影響

2.2.3 固定化最佳反應(yīng)溫度

取4只100 mL三角瓶,各加10 mg活化的磁性微球,加入30 mL的RNA溶液,分別在20、30、40和50 ℃進(jìn)行固定化4 h。用磁場將磁性微球沉淀,過濾,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對RNA固定化的影響

Fig.3 Effect of temperature on RNA immobilization

由圖3可見,隨著固定化溫度的提高,上清液中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低,40 ℃時(shí)達(dá)到最低,當(dāng)溫度超過40 ℃,上清液中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高。因此固定化最佳反應(yīng)溫度確定為40 ℃。

3 結(jié) 論

通過對RNA提取條件的優(yōu)化,得到了濃鹽法提取啤酒酵母RNA的最佳工藝條件,并將提取的RNA進(jìn)行磁性固定化,得到磁性固定化RNA的最佳條件。在提取時(shí)間為4 h、提取溫度100 ℃、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%和酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的最優(yōu)條件下,RNA的提取率達(dá)到6.13%,其中RNA提取時(shí)間對提取率的影響最為顯著。RNA的最佳固定化條件為,RNA的添加量30 mL(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),固定溫度40 ℃,固定化時(shí)間4 h。

本實(shí)驗(yàn)對siRNA新型給藥系統(tǒng)的發(fā)明進(jìn)行探索,為RNAi技術(shù)的應(yīng)用開拓一個(gè)新的道路。

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