劉一萌，馬家海，文茜

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海201306)

壇紫菜Porphyra haitanensis和條斑紫菜Porphyra yezoensis是中國主要的紫菜栽培種。壇紫菜主要產(chǎn)于中國福建省、浙江省、廣東省，是中國特有的暖溫帶性經(jīng)濟(jì)海藻［1-2］。根據(jù)農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局公布的數(shù)據(jù)［3］，2010年壇紫菜產(chǎn)量 (浙、閩、粵三省)、條斑紫菜產(chǎn)量 (蘇、魯二省)分別為82 767、24 468 t。壇紫菜產(chǎn)量是條斑紫菜產(chǎn)量的3倍多，是中國產(chǎn)量最高的紫菜栽培種。近年來，隨著紫菜栽培面積的不斷擴(kuò)大，海區(qū)環(huán)境不斷惡化，以及管理上出現(xiàn)的種種問題，導(dǎo)致紫菜病害時(shí)有發(fā)生，2005、2008、2010年度福建省壇紫菜病爛率分別為26.7%、20%、28%，而2008年度內(nèi)，福建省福鼎市壇紫菜病爛率高達(dá)80%［4-7］，給紫菜生產(chǎn)企業(yè)帶來了巨大損失。目前，國內(nèi)對(duì)于紫菜的病害研究多見于條斑紫菜，而對(duì)壇紫菜的病害研究則遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于條斑紫菜。研究報(bào)道的條斑紫菜病害主要有赤腐?。?］、擬油壺菌?。?］、絲狀細(xì)菌附著癥［10］等，而關(guān)于壇紫菜病害的研究，多為對(duì)紫菜病害的預(yù)防以及發(fā)病后的對(duì)策，僅對(duì)紅爛病的研究較為深入［11-12］。對(duì)壇紫菜赤腐病的報(bào)道僅僅是觀察到紫菜腐霉菌絲的存在［13］，對(duì)該病害的研究還不透徹，對(duì)壇紫菜擬油壺菌病的研究國內(nèi)幾乎是空白。Ding等［14］曾研究過條斑紫菜上赤腐病與壺狀菌病并發(fā)病，而對(duì)壇紫菜并發(fā)病的研究目前尚未見報(bào)道。為此，作者對(duì)壇紫菜赤腐病和擬油壺菌病并發(fā)病過程進(jìn)行研究，旨在探明壇紫菜上紫菜腐霉Pythium porphyrae以及擬油壺菌Olpidiopsis sp.的生活史，并為建立防治該病的體系及技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究課題組分別于2009年11月至2010年2月、2010年9月至2011年2月和2011年8月至2012年2月，對(duì)福建省晉江市、福鼎市、霞浦縣以及浙江省蒼南等壇紫菜栽培海區(qū)環(huán)境條件以及壇紫菜栽培的發(fā)病狀況進(jìn)行調(diào)查。

試驗(yàn)用壇紫菜采自上述調(diào)查海區(qū)，壇紫菜樣品經(jīng)陰干，在0～4℃低溫下12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 樣品的挑選與處理 挑取部分患有病爛的壇紫菜葉狀體，利用過濾消毒海水清洗紫菜葉狀體，并用消毒毛筆反復(fù)洗刷葉片表面，清除附著物。將清洗過的壇紫菜葉狀體置于過濾后密度為1.020 kg/m3的消毒海水中，加入2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)PES營養(yǎng)液，進(jìn)行充氣培養(yǎng)，每隔3～4 d加入2%的PES培養(yǎng)液，每隔7 d換水1次。培養(yǎng)條件:溫度為20℃，光照強(qiáng)度為48.07～64.1 μmol/(m2·s)，光周期為10L∶14D。將剩余病爛的壇紫菜樣品經(jīng)消毒海水清洗，陰干至含水量為20%～30%后，置于-20～-18℃冰箱中保存。挑取正常壇紫菜葉狀體置于上述相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以供對(duì)照。

1.2.2 切片的制備與觀察 將培養(yǎng)的病爛壇紫菜和冰箱中保存的病爛壇紫菜用海水復(fù)蘇培養(yǎng)后，切取該葉片的病爛部位，并制作成臨時(shí)裝片，利用顯微鏡Olympus Bh41和相機(jī)MicroPublisher 5.0 RTV對(duì)病癥特征進(jìn)行觀察和記錄。利用Leica CM1900冷凍切片機(jī)對(duì)患病部位進(jìn)行橫切，制作成切片進(jìn)行觀察。正常壇紫菜的切片制備與觀察同病爛壇紫菜。

2 結(jié)果

2.1 病害發(fā)病分布特征

采集到的患有病爛的壇紫菜，多為近海栽培密集的壇紫菜，特別是在內(nèi)灣栽培的紫菜，而河口附近的栽培海區(qū)，病爛最為嚴(yán)重 (圖1-A)，大多數(shù)網(wǎng)簾上出現(xiàn)了空網(wǎng)現(xiàn)象。同一張網(wǎng)簾上，中心病爛程度大于周邊;而在同一內(nèi)灣，灣口紫菜病爛少;遠(yuǎn)海海區(qū)的壇紫菜病爛較少 (圖1-B)。

圖1 網(wǎng)簾上的壇紫菜Fig.1 The laver Porphyra haitanensis on nori nets

2.2 患病紫菜的癥狀

患有病爛的壇紫菜有不同程度的病斑、病爛，肉眼觀察病斑多為圓形，顏色為綠色或黃綠色，接著這些病斑便會(huì)潰爛成孔洞，部分藻體上有時(shí)可見到紅色水泡 (圖2-A)。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病斑大片連接，形成較大的孔洞，加上風(fēng)浪作用，紫菜隨即脫落，造成損失。而海區(qū)栽培的壇紫菜，有部分患病紫菜葉狀體病斑在剛轉(zhuǎn)為綠色、黃綠色，并沒有形成孔洞時(shí)，便會(huì)因風(fēng)浪的作用而破碎，致使紫菜減產(chǎn)。經(jīng)觀察，病斑在藻體梢部、中部和基部都有發(fā)生，藻體梢部邊緣較為嚴(yán)重 (圖2-B)，而病斑出現(xiàn)在基部時(shí)會(huì)使紫菜整體脫落，造成壇紫菜大幅減產(chǎn)。

圖2 患有赤腐病和擬油壺菌病的壇紫菜Fig.2 Simultaneous infection by red rot and olpidiopsdisease in the laver Porphyra haitanensis

2.3 紫菜腐霉菌侵染壇紫菜的過程

紫菜腐霉游動(dòng)孢子呈腎臟狀，具有兩根等長的鞭毛，各向前、后伸出 (圖3-A)。游動(dòng)孢子釋放后，遇到紫菜葉片，便會(huì)附著在葉片表面，并很快會(huì)伸出萌發(fā)管侵染紫菜細(xì)胞 (圖3-B)，鏡檢顯示，與正常壇紫菜細(xì)胞 (圖3-C)相比，被腐霉菌感染的壇紫菜細(xì)胞有菌絲體穿透現(xiàn)象 (圖3-D)，一條菌絲體可貫穿多個(gè)紫菜細(xì)胞，呈鏈珠狀;各條菌絲縱橫交錯(cuò)生長，密布成網(wǎng)，此為紫菜赤腐病的顯著特點(diǎn)。被穿透的紫菜細(xì)胞萎縮死亡，死亡細(xì)胞呈深紅色，不久，死亡細(xì)胞腐爛，藻紅素溶出，聚集在病斑處，形成紅泡。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，可見到同一個(gè)紫菜細(xì)胞同時(shí)被多根菌絲穿透 (圖3-E)，部分菌絲甚至可伸出葉片外 (圖3-F)。腐爛后的細(xì)胞為綠色、黃綠色，最后病斑破裂，形成孔洞。腐霉菌絲侵染壇紫菜5～7 d后，部分菌絲上會(huì)形成一球囊結(jié)構(gòu)，即孢子囊，內(nèi)含淡青色顆粒為游動(dòng)孢子 (圖3-G)，此為腐霉菌絲的無性生殖器。在一定條件下，部分腐霉菌絲上可形成一膨大球狀有性生殖器，內(nèi)含一個(gè)卵孢子，此為藏卵器(圖3-H)，外有一半球狀結(jié)構(gòu)，為藏精器。

2.4 擬油壺菌侵染壇紫菜的過程

鏡檢發(fā)現(xiàn)在患有赤腐病的藻體病斑上，部分紫菜細(xì)胞膨大，呈橢圓體或球形，內(nèi)有明亮的油滴，一端有濃綠色突起，此為擬油壺菌病的典型癥狀。

擬油壺菌游動(dòng)孢子大小為2.0～3.5 μm(圖4-A)，為白色或淡青色，具有長短不同的兩根鞭毛，游動(dòng)孢子釋放在水體里遇到壇紫菜葉片，便會(huì)附著在其表面，并感染健康的壇紫菜細(xì)胞 (圖4-B)。在擬油壺菌發(fā)病初期，可在被感染的壇紫菜細(xì)胞中觀察到有外膜包被的球形透明菌體，內(nèi)含數(shù)個(gè)明亮的油滴 (圖4-C)，與正常壇紫菜細(xì)胞液泡有明顯區(qū)別。隨后，菌體不斷生長膨大，將壇紫菜細(xì)胞內(nèi)容物逐漸擠壓到細(xì)胞一端，形成濃綠色突起 (圖4-D)。嚴(yán)重時(shí)，部分壇紫菜細(xì)胞內(nèi)可觀察到寄生了2個(gè)甚至更多菌體的現(xiàn)象 (圖4-E、F)，該菌體亦可侵入壇紫菜精細(xì)胞內(nèi) (圖4-G)。侵入壇紫菜細(xì)胞的菌體逐漸成熟，形成孢子囊，內(nèi)含游動(dòng)孢子 (圖4-H)，但在精細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有孢子囊形成。孢子囊成熟后，便向細(xì)胞外伸出排放管，并通過排放管釋放出游動(dòng)孢子 (圖4-I、J)。孢子釋放后，僅殘留孢子囊壁以及破碎的紫菜細(xì)胞壁(圖4-K)，不久該部位破裂形成孔洞 (圖4-L)。

3 討論

本研究中，在采集到的患病壇紫菜上，由菌絲穿透紫菜細(xì)胞，致使紫菜細(xì)胞萎縮死亡，并通過孢子囊進(jìn)行無性生殖，產(chǎn)生游動(dòng)孢子感染其他健康紫菜細(xì)胞，并在一定條件下菌絲上形成藏卵器、藏精器等有性生殖器結(jié)構(gòu)，與條斑紫菜赤腐病癥狀相符，可確定該菌絲為腐霉菌絲，由其引發(fā)的病害為赤腐病 (red rot disease)。條斑紫菜赤腐病是由紫菜腐霉 Pythium porphyrae寄生引起的，新崎盛敏［15］最先研究該菌屬于腐霉菌科的腐霉屬Pythilum，Takahashi［16］將其定名為 Pythilum porphyrae，之后先后有學(xué)者對(duì)該病進(jìn)行了深入研究，F(xiàn)ujita等［17］、Uppalapati等［18］認(rèn)為，可以通過菌絲、藏卵器、藏精器等形態(tài)特征以及寄生對(duì)象確定寄生菌是否為紫菜腐霉菌，紫菜腐霉菌Pythium porphyrae在分類學(xué)上的分類階元為卵菌門Oomycota、卵菌綱Oomycetes、霜霉目Peronosporates、腐霉科Pythiaceae、腐霉屬 Pythium［16，19-20］。紫菜擬油壺菌病(olpidiops disease)最早被發(fā)現(xiàn)在條斑紫菜上，報(bào)道指出，僅能依靠形態(tài)學(xué)特征確定此菌［20］，其顯著特征為:菌體內(nèi)含有油亮顆粒，在生長過程中不斷增大，將紫菜細(xì)胞內(nèi)含物推擠到一側(cè)，形成濃綠色突起，并在寄主細(xì)胞內(nèi)形成孢子囊進(jìn)行無性繁殖，以及孢子囊伸出排放管釋放游動(dòng)孢子。該病原菌侵染細(xì)胞后形成一“壺狀”結(jié)構(gòu)，因此，在國內(nèi)該病一直以來被命名為“壺菌病”(或“壺狀菌病”)，易與壺菌Chytridium sp.相混淆，壺菌在分類上屬于壺菌綱Chytridiomycetes、壺菌目Chytridialas。周與良等［21］經(jīng)過研究，將擬油壺菌屬分類于卵菌綱Oomycotes、鏈壺菌目Lagenidiales。李宇航等［10］將該病命名為“擬油壺菌病”。

在同一片患病壇紫菜葉片上，可觀察到存在赤腐病病斑的同時(shí)，還存在擬油壺菌病，是赤腐病和擬油壺菌病的并發(fā)病 (圖3-B)。太田扶桑男曾指出，在條斑紫菜上擬油壺菌病的發(fā)生往往會(huì)與其他病害一同發(fā)生，導(dǎo)致紫菜產(chǎn)量下降［22］。

兩種病害導(dǎo)致的病爛在壇紫菜幼葉以及成熟葉狀體上都有發(fā)生，并且各自進(jìn)行感染，加大了病爛程度，同時(shí)也加快了紫菜脫落流失速度，給紫菜生產(chǎn)帶來巨大危害。赤腐病及擬油壺菌病同為寄生性微生物引起的傳染性病害，目前，兩種病害還沒有有效的治療手段。但可在病害出現(xiàn)早期，及時(shí)采收紫菜，能夠有效地減少病害造成的損失。低鹽度利于腐霉菌絲的生長［8，22］，為赤腐病發(fā)生提供了條件;而壇紫菜擬油壺菌病發(fā)病之前，有時(shí)可見到細(xì)胞內(nèi)容物異常，如細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)液泡，這或許是擬油壺菌感染紫菜的條件之一，液泡的出現(xiàn)與海水比重降低有一定的關(guān)系，這與種植在河口附近的紫菜患病率高的調(diào)查結(jié)果相一致，因此，低鹽度是引發(fā)兩種病害同時(shí)爆發(fā)的誘因之一。腐霉菌絲宜于生長在較高水溫環(huán)境下，特別是在天氣突然升溫，并且高溫持續(xù)一定時(shí)間的情況下，宜于爆發(fā)赤腐病。

赤腐病以及擬油壺菌病多在水體交換差的海區(qū)內(nèi)爆發(fā)，而本次調(diào)查的壇紫菜栽培海區(qū)大多都集中在近海，特別是內(nèi)灣。內(nèi)灣水流不暢，營養(yǎng)鹽補(bǔ)給、水溫調(diào)節(jié)以及氣體交換差，為兩種病害同時(shí)爆發(fā)創(chuàng)造了有利條件，海區(qū)紫菜栽培密度過大，栽培筏架設(shè)置密度過高，加劇了海水交換不暢，更易引發(fā)兩種病害的發(fā)生;遠(yuǎn)海以及灣口紫菜病害發(fā)病較少，原因可能是，兩種病害都是通過游動(dòng)孢子進(jìn)行傳染，而遠(yuǎn)海和灣口水流暢通，栽培密度小，水體交換速度快，紫菜腐霉以及擬油壺菌游動(dòng)孢子不易附著于紫菜葉片上，很難侵染紫菜，有利于壇紫菜健康生長，這與海區(qū)調(diào)查結(jié)果相一致。因此，合理布局對(duì)于預(yù)防病害發(fā)生和減緩病害程度都有著積極意義［23］。對(duì)于已經(jīng)發(fā)生病害的網(wǎng)簾，要及時(shí)撤下來，以免擴(kuò)大傳染。日本資源協(xié)會(huì)認(rèn)為，在條斑紫菜赤腐病的防治上，用有機(jī)酸等藥物處理患病紫菜，可殺死紫菜腐霉菌絲［24］;一些物理手段也可以有效減緩兩種病害發(fā)生帶來的危害，紫菜腐霉菌絲和擬油壺菌的游孢子對(duì)于干燥的忍受力很差，在發(fā)病初期增加葉狀體干出時(shí)間，如調(diào)高網(wǎng)簾高度，延長干出時(shí)間，可抑制赤腐菌絲和擬油壺菌菌體的生長，一定程度上減緩兩病的蔓延。但是由于擬油壺菌是寄生在紫菜細(xì)胞內(nèi)部，干出并不能很有效地殺死菌體，只能減少擬油壺菌的傳染。低溫可以同時(shí)抑制腐霉菌絲和擬油壺菌菌體的生長，因此，利用冷藏網(wǎng)技術(shù)，也可減緩兩種病害的蔓延。如遇到連日降雨的天氣或其他利于病害發(fā)生的條件時(shí)，可將附有紫菜的網(wǎng)簾從海區(qū)撤下來，及時(shí)陰干，存于冷庫中，待度過雨水天氣后，再將網(wǎng)簾掛出來，以規(guī)避病害爆發(fā)期。

圖3 紫菜腐霉菌侵染壇紫菜的過程Fig.3 Development process of Pythium porphyrae on Porphyra haitanensis

圖4 擬油壺菌侵染壇紫菜的過程Fig.4 Development process of Olpidiopsis sp.on Porphyra haitanensis

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