丁君，孫巍，常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

硬脂酰輔酶A去飽和酶 (Stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD)基因是調(diào)控飽和脂肪酸向單一不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，在脂肪酸生物合成中起著中心調(diào)控作用［2］，可通過信號傳導(dǎo)調(diào)控動(dòng)物的采食量、能量代謝和機(jī)體內(nèi)分泌等生理活動(dòng)。SCD作為脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)記基因，其活性的高低會影響動(dòng)物脂肪細(xì)胞的增殖和增長［3］。目前，有研究者已 對人［4-5］、雞［6］、豬［7-8］、綿羊［9］、山羊［10-11］、牛［12］、小鼠［13-14］和大鼠［15］等的 SCD 基因進(jìn)行了克隆和測序，但對無脊椎動(dòng)物SCD基因的研究較少。

蛋白酪氨酸磷酸酶 (Protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)基因是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)并錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的磷酸酶，它是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)胞內(nèi)酶的代表［16］。PTP1B基因沒有特異性受體，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同蛋白底物的酪氨酸磷酸化水平而參與各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已證實(shí)，PTP1B基因可與胰島素受體、表皮生長因子等某些受體型酪氨酸激酶及多種生長因子、底物互相作用，以調(diào)控細(xì)胞的生長分化［17］。

本研究中，作者查閱了KEGG數(shù)據(jù)庫中海膽脂肪酸代謝通徑，選取并克隆了SCD和PTP1B基因，檢測了SCD和PTP1B基因在海膽胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，旨在為從分子水平上探討海膽脂代謝過程中的基因功能提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蝦夷馬糞海膽為農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的2齡海膽。

Trizol Reagent、RNA PCR Kit(AMV)3.0、載體pMD19-T Vector均為寶生物工程 (大連)有限公司產(chǎn)品;異丙醇、分析乙醇、RnaseA、DEPC、MOPS、氨芐青霉素鈉鹽均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit為美國Clontech公司產(chǎn)品;Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit購自O(shè)mega Biotek公司;限制性內(nèi)切酶購自 Promega公司;Tryptone、YeastExtract購自O(shè)xoid公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Taq DNA聚合酶聚核苷酸引物由寶生物工程 (大連)有限公司合成;大腸桿菌表達(dá)宿主為農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)與篩選 通過與加州紫海膽和馬糞海膽SCD、PTP1B基因序列的比對，找出保守序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段引物SCD-F1、SCD-R1、PTP1BF1、PTP1B-R1(表 1)。

1.2.2 胚胎不同發(fā)育時(shí)期蝦夷馬糞海膽總RNA的提取、cDNA的合成及目的基因的PCR擴(kuò)增 分別取發(fā)育至2細(xì)胞期、囊胚期、原腸期和八腕期的蝦夷馬糞海膽胚胎、幼蟲樣品各100 μL，提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測總RNA質(zhì)量。

高中生傳統(tǒng)文化素養(yǎng)的缺失不僅通過上述問題反映出來，在其他很多方面也有所體現(xiàn)。究其原因，高中生對于傳統(tǒng)文化的掌握量少、獲取相關(guān)知識的途徑受限、學(xué)習(xí)研究的興趣不濃是多方面原因共同作用的結(jié)果。

使用TAKARA公司的cDNA Library Construction Kit試劑盒，利用反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、Oligo(dT)18 Anchor Primer和5-methyldCTP合成第一鏈cDNA(含有NotⅠ 酶切位點(diǎn))。

以cDNA為模板，根據(jù)所設(shè)計(jì)的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性1 min，57℃下退火1 min，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下保溫10 min。PCR產(chǎn)物使用10 g/L的瓊脂糖電泳檢測，分離純化的目的基因片段連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸肝菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1.2.3 采用RACE PCR技術(shù)獲得全長序列 采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)，根據(jù)已經(jīng)獲得的目的基因部分片段設(shè)計(jì)基因特異性引物進(jìn)行5'cDNA和3'cDNA末端克隆。5'cDNA和3'cDNA末端克隆按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行操作，PCR產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖電泳檢測，分離純化的目的基因片段連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸肝菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，將測序后的序列與以獲得的目的片段進(jìn)行拼接，獲得cDNA全長。所用的特異性引物見表1。

表1 克隆SCD、PTP1B基因的主要引物Tab.1 The cloning primers of SCD and PTP1B genes

1.2.4 目的基因的生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果用VecScreen(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Vec-Screen/VecScreen.html)去除載體序列，用bl2seq(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/bl2seq/wbl-ast2.cgi)進(jìn)行比對拼接，得到各基因的全長cDNA序列;用ExPasy軟件包中的Compute pI/Mw tool(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html.)預(yù)測等電點(diǎn)和分子質(zhì)量，用the program SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號肽序列;用Mega 4.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測目的基因的表達(dá)采用△△CT法檢測胚胎不同發(fā)育時(shí)期海膽SCD、PTP1B基因的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系以cDNA第一鏈為模板，以β-actin作為內(nèi)參基因，β-actin引物和目的基因定量引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳檢測無引物二聚體，且每對定量引物擴(kuò)增出單一的含有已知序列的片段，再經(jīng)預(yù)試驗(yàn)對引物和模板濃度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)條件如下:94℃下預(yù)變性30 s;94℃下變性5 s，60℃下退火32 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在95℃下變性15 s，60℃下退火1 min，95℃下延伸15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果由ABI step one Software系統(tǒng)進(jìn)行分析，以β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量校正目的基因的相對表達(dá)量。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、標(biāo)本重復(fù)性及組間差異的比較。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測海膽胚胎的總RNA，可見清晰的28S、18S和5S 3條RNA條帶。表明總RNA沒有降解，提取的RNA質(zhì)量較高。

2.2 蝦夷馬糞海膽SCD和PTP1B基因片段的PCR擴(kuò)增

以總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的片段。將目的片段切膠回收、連接質(zhì)粒后測序，得到440、630 bp兩條序列片段。

2.3 RACE-PCR擴(kuò)增

以總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的5'RACE 1 st cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行5'RACE擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小一致的424 bp的5'SCD片段和433 bp的5'PTP1B片段。

以總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的3'RACE 1 st cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行3'RACE擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小一致的962 bp的3'SCD片段和488 bp的3'PTP1B片段。

2.4 蝦夷馬糞海膽SCD基因的序列分析

將用5'RACE、3'RACE引物獲得的SCD基因片段和用引物調(diào)取的SCD中間片段進(jìn)行拼接，得到全長為1 934 bp的SCD基因cDNA序列 (Genbank登錄號為HM208174)，該序列包括153 bp的5'非編碼區(qū) (Untranslated region，UTR)、819 bp的開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)和962 bp的3'非編碼區(qū)。推測的SCD基因cDNA多聚腺苷酸加尾信號 (Polyadenylation signal)為AATAA，開放閱讀框編碼273個(gè)氨基酸殘基，該多肽的理論相對分子質(zhì)量為31 600，等電點(diǎn)為8.43。

使用SingaIP軟件分析蝦夷馬糞海膽SCD基因的氨基酸序列，表明SCD基因存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，為分泌性蛋白。用Predict Protein軟件分析推測的SCD基因氨基酸序列含有以下位點(diǎn):2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉逗蔻?；稽c(diǎn)。多序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種的SCD基因中間部分序列保守性較高，序列兩端的差異性較大。

2.5 蝦夷馬糞海膽SCD基因的進(jìn)化分析

采用Neibor-Joining方法構(gòu)建不同物種SCD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖1可見:蝦夷馬糞海膽與紫球海膽首先聚到一起，進(jìn)化關(guān)系最近;魚類和哺乳動(dòng)物也各自聚為一類。海膽在進(jìn)化地位上位于脊椎動(dòng)物和昆蟲之間。

圖1 不同物種SCD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of SCD gene in different species

2.6 蝦夷馬糞海膽SCD基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析蝦夷馬糞海膽SCD基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。從圖2可見:隨著海膽胚胎的發(fā)育，SCD基因表達(dá)量呈逐漸升高趨勢。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:SCD基因在八腕期的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期 (P＜0.01)，在2細(xì)胞期與囊胚期的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。

圖2 SCD基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況Fig.2 The expression of SCD gene at different stages of embryonic development

2.7 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的序列分析

將用5'RACE、3'RACE引物獲得的PTP1B基因片段和用引物調(diào)取的PTP1B的中間片段進(jìn)行拼接，得到全長為1 249 bp的PTP1B基因cDNA序列 (Genbank登錄號為HM208173)，該序列包括104 bp的5'非編碼區(qū)、657 bp的開放閱讀框和488 bp的3'非編碼區(qū)。推測的PTP1B基因cDNA多聚腺苷酸加尾信號為AATAA，開放閱讀框編碼219個(gè)氨基酸殘基，該多肽的理論相對分子質(zhì)量為25 200，等電點(diǎn)為8.37。

用SingaIP軟件分析蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的氨基酸序列，表明PTP1B存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，為分泌性蛋白。用Predict Protein軟件分析推測的PTP1B基因氨基酸序列含有以下位點(diǎn):1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉逗蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)酪氨酸蛋白磷酸酶的活性位點(diǎn)。推測的PTP1B氨基酸序列含有兩個(gè)半胱氨酸 (Cys4和Cys58)，可形成二硫鍵。多序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種的PTP1B基因保守性較高。

2.8 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的進(jìn)化分析

采用Neibor-Joining方法構(gòu)建不同物種PTP1B基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖3可見，蝦夷馬糞海膽與紫球海膽先聚為一類，進(jìn)化關(guān)系最近;哺乳動(dòng)物聚為一類;海膽雖為后口動(dòng)物，但進(jìn)化地位仍低于魚類和兩棲類。

圖3 不同物種PTP1B基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of PTP1B gene in different species

2.9 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析蝦夷馬糞海膽PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。從圖4可見，PTP1B基因表達(dá)量隨著海膽胚胎發(fā)育呈逐漸下降趨勢。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:PTP1B基因在2細(xì)胞期表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期 (P＜0.01)，在原腸期與八腕期的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。

3 討論

有關(guān)SCD基因克隆和測序多用于對哺乳動(dòng)物和植物的研究，而對無脊椎動(dòng)物的研究較少。本研究中成功克隆了蝦夷馬糞海膽SCD基因，推測SCD全長有273個(gè)氨基酸，存在信號肽，推測的SCD基因氨基酸序列有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)。通?；蛑械墓δ芪稽c(diǎn)與蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、加工有關(guān)，其中N-糖基化位點(diǎn)能使蛋白質(zhì)抵抗消化酶的作用，并且某些蛋白只有在糖基化之后才能正確折疊，具有傳導(dǎo)信號的功能［18］;蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)與介導(dǎo)胞外分泌有關(guān)［19］;酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有關(guān)［20］，N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜［21］，表明其為分泌性蛋白，參與介導(dǎo)胞外分泌。研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷馬糞海膽SCD基因含有3個(gè)跨膜區(qū)域，這與現(xiàn)有報(bào)道的SCD基因均存在4個(gè)跨膜區(qū)域不同，其原因和效應(yīng)還需進(jìn)一步探討。SCD基因在不同物種中的序列保守性較高，本研究中通過比對蝦夷馬糞海膽與其他物種的SCD基因序列，發(fā)現(xiàn)SOD基因中部序列相對保守，C端和N端則缺乏同源性，這一結(jié)論與Man等［22］的研究結(jié)果一致。

圖4 PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況Fig.4 The expression of PTP1B gene at different stages of embryonic development

分析不同物種SCD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，蝦夷馬糞海膽和紫球海膽進(jìn)化關(guān)系最近，海膽在進(jìn)化地位上位于脊椎動(dòng)物和昆蟲中間。因此，根據(jù)不同物種SCD基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能較真實(shí)地體現(xiàn)蝦夷馬糞海膽SCD基因的分類地位。

推測的蝦夷馬糞海膽PTP1B全長有219個(gè)氨基酸，存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸蛋白磷酸酶活性位點(diǎn)，酪氨酸激酶位點(diǎn)與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞周期以及從細(xì)胞外環(huán)境傳遞各種信號有關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，PTP1B基因表達(dá)量隨著海膽胚胎的發(fā)育呈逐漸下降趨勢。推測其與生長因子及底物互相作用，在胚胎發(fā)育的較早階段調(diào)控細(xì)胞的生長分化。

蝦夷馬糞海膽SCD、PTP1B基因的成功克隆及其在胚胎不同發(fā)育期的表達(dá)研究，對于深入探討棘皮動(dòng)物脂肪酸代謝相關(guān)基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)理具有重要意義，進(jìn)而在分子水平上為蝦夷馬糞海膽的良種培育提供科學(xué)依據(jù)。

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