黃立群，儀慧蘭，崔松林，郭軍

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006;2.山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，山西太原030006;3.中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西太原030006)

中國(guó)大鯢Andrias davidianus俗稱“娃娃魚(yú)”，屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物。隱鰓鯢科有隱鰓鯢屬Cryptobranchus和大鯢屬Andrias 2個(gè)屬，共計(jì)3個(gè)種，其中隱鰓鯢屬的北美隱鰓鯢Cryptobranchus alleganiensis分布于美國(guó)東部，大鯢屬的日本大鯢Andrias japonicus和中國(guó)大鯢分別分布于日本和中國(guó)［1］。中國(guó)大鯢是中國(guó)特有的珍稀有尾兩棲動(dòng)物，屬于國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，從水系看主要分布于長(zhǎng)江中上游、珠江上游及黃河流域的部分地區(qū)［2］。楊麗萍等［3］對(duì)中國(guó)大鯢5個(gè)野生種群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進(jìn)行了研究，并結(jié)合化石證據(jù)，推測(cè)中國(guó)大鯢由北向南進(jìn)行擴(kuò)散。山西省翼城、垣曲、陽(yáng)城、沁水四縣交界處的歷山是現(xiàn)今野生大鯢分布的最北端，歷山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的野生大鯢資源是中國(guó)大鯢重要的組成部分，可能在種群演化歷史中起到了重要作用。近年來(lái)，由于大鯢棲息地環(huán)境惡化以及人為亂捕濫殺，造成野生大鯢資源量銳減，部分地區(qū)瀕臨滅絕［4］。為此，開(kāi)展大鯢群體遺傳學(xué)研究，確定中國(guó)大鯢不同種群之間的遺傳關(guān)系，對(duì)大鯢的人工繁育和種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。

線粒體DNA(mtDNA)由于呈母系遺傳，且堿基替換速率快，無(wú)組織特異性，是兩棲類進(jìn)化研究中重要的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)及進(jìn)化史等方面的研究中［5-6］。Cyt b由于進(jìn)化速度適中，被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題最可信的分子標(biāo)記之一［7-9］，但單個(gè)線粒體基因在反映脊椎動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系時(shí)可能效果不佳［10］。為此，本研究中作者以mtDNA中Cyt b和ATPase 6序列為分子標(biāo)記，比較了歷山野生大鯢與其他地域中國(guó)大鯢的序列差異，從分子水平上探討它們之間的相互關(guān)系，以期為大鯢的保護(hù)、繁殖和育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用野生大鯢2尾，于2010年取自歷山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)，1號(hào)樣本取其肌肉組織，2號(hào)樣本采用大鯢自然生理過(guò)程中脫掉的皮，經(jīng)生理鹽水清洗后用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡，兩種樣品均在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 大鯢組織用生理鹽水浸洗后，剪碎，稱取約50 mg置于1.5 mL離心管中，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，經(jīng)TE溶解后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增時(shí)Cyt b引物參考Murphy等［11］的引物序列，ATPase 6引物為自行設(shè)計(jì)引物 (表1)，PCR反應(yīng)程序:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，退火30 s，72℃下延伸40 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。退火溫度分別為51℃和57℃。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收目的條帶送華大基因公司測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used in PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)處理

為了比較大鯢種群線粒體序列變異，從NCBI上收集到已知來(lái)源的中國(guó)大鯢樣本14尾 (表2)。中國(guó)大鯢樣本按地域來(lái)源及水系進(jìn)行編號(hào)，其中AH代表安徽樣本，GX代表廣西樣本，HN代表湖南樣本，SC代表四川樣本，ShX代表陜西樣本，SX代表山西 (垣曲)樣本;Y代表黃河水系，YZ代表長(zhǎng)江水系，P為珠江水系;SX1-Y和SX2-Y為所測(cè)歷山樣本。

使用軟件Geneious Pro 5.1.7輔助人工校對(duì)DNA序列，相關(guān)序列的收集、比對(duì)由Geneious軟件完成［12］。用Mega 5.0軟件統(tǒng)計(jì)序列之間的堿基差別，計(jì)算核苷酸使用頻率，采用ML(Maximum likelihood)法和MP(Maximum parsimony)法分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，ML采用Kimura雙參數(shù)模型，Bootstrap 1000循環(huán)檢驗(yàn)結(jié)果為各分支的置信度。

表2 大鯢樣本來(lái)源Tab.2 The samples of Chinese giant salamander collected from different areas

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者普遍采用大鯢肌肉或肝臟組織提取DNA，但Matsui等［13-14］曾從大鯢腳趾尖、尾尖及表皮中提取DNA。大鯢在飼養(yǎng)過(guò)程中會(huì)經(jīng)常脫皮 (10～30 d脫皮一次)［15］，本試驗(yàn)中嘗試采用常規(guī)酚-氯仿抽提法從2號(hào)大鯢樣本所脫皮中提取DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所提DNA樣品產(chǎn)生單一條帶，純度高，無(wú)降解，與肌肉來(lái)源的DNA相似。這說(shuō)明，對(duì)于大鯢這樣的珍稀保護(hù)動(dòng)物，完全可以采用非損傷取樣進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究。

2.2 Cyt b區(qū)域DNA序列的組成與變異

測(cè)定和收集了中國(guó)大鯢6個(gè)不同地理區(qū)域16個(gè)樣本的Cyt b基因序列，有效片段長(zhǎng)為305 bp，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)不同的單倍型。對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析，共檢測(cè)出14個(gè)變異位點(diǎn) (圖1-A)，占核苷酸總數(shù)的4.58%，其中有12個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn)上 (占64.3%)，第1、第2位點(diǎn)變異數(shù)分別占總變異數(shù)的28.6%和7.1%。沒(méi)有任何堿基的插入或缺失，其中A、T、G和 C堿基平均含量分別為23.9%、35.1%、18.9%和22.1%，堿基組成的百分比顯示了G的相對(duì)缺乏，A+T平均含量為59%，G+C含量為41%。核苷酸的替換以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)多于顛換(13/1)，表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏倚［16］，其中A←→G轉(zhuǎn)換 (8)比T←→C(5)轉(zhuǎn)換略多。

圖1 歷山大鯢Cyt b和ATPase 6序列多態(tài)性位點(diǎn)分布Fig.1 Polymorphic sites in the Cyt b and ATPase 6 sequences of Chinese giant salamander in Lishan region

2.3 ATPase 6區(qū)域DNA序列的組成與變異

檢測(cè)ATPase 6基因序列有效片段長(zhǎng)為371 bp，有13個(gè)不同的單倍型，發(fā)現(xiàn)30個(gè)變異位點(diǎn)，占核苷酸總數(shù)的8.09%(圖1-B)，其中有18個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn)上(占50%)，第1、第2位點(diǎn)變異數(shù)分別占總變異數(shù)的43.3%和6.7%。沒(méi)有堿基的插入或缺失，其中A、T、G和 C堿基平均含量分別為 29.1%、35.2%、12.3%和23.4%，堿基組成百分比同樣顯示了G的相對(duì)缺乏，A+T平均含量為64.3%，而G+C含量只有35.7%。核苷酸的替換以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)多于顛換 (22/8)，同樣表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏倚，其中A←→G轉(zhuǎn)換 (14)也多于T←→C轉(zhuǎn)換 (8)。與Cyt b序列相比，ATPase 6序列具有更高的變異度，但兩序列堿基組成同樣表現(xiàn)出了G的缺乏，多數(shù)變異發(fā)生在的密碼子的第三位，且變異以轉(zhuǎn)換為主。

2.4 分子系統(tǒng)樹(shù)

大鯢種群地理關(guān)系比較復(fù)雜，因此采用ML和MP兩種方法構(gòu)建6個(gè)不同地理區(qū)域中國(guó)大鯢Cyt b和ATPase 6合并序列的分子系統(tǒng)樹(shù)。合并序列全長(zhǎng)為676 bp，以新疆北鯢Ranodon sibiricus作為外群，Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗(yàn)結(jié)果作為各分支的置信度 (圖2)。兩種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)具有基本相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分為3個(gè)分支，其中安徽個(gè)體聚在一起為一單獨(dú)分支，廣西個(gè)體和湖南一個(gè)體聚為一支，而山西、陜西、四川及湖南兩個(gè)體聚為另一分支。歷山大鯢樣本與廣西樣本的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.032，與四川、陜西樣本的遺傳距離較近。長(zhǎng)江流域種群與黃河流域種群共享有單倍型HN1-YZ(SX1-Y)，長(zhǎng)江流域種群與珠江流域種群共享有單倍型GX2-P(HN2-YZ)，而黃河流域與珠江流域的地理種群沒(méi)有共享的單倍型。從流域來(lái)看，黃河流域大鯢聚在第1分支，珠江流域大鯢聚在第2分支，長(zhǎng)江流域大鯢則分布于第3分支。由此可見(jiàn)，大鯢的遺傳分化呈現(xiàn)出地理區(qū)域上的連續(xù)性:長(zhǎng)江流域介于黃河流域和珠江流域之間，其種群與其它種群之間遺傳距離較近且存在交叉，而黃河流域與珠江流域種群沒(méi)有交叉，這與陶峰勇等［17］的研究結(jié)果一致。

圖2 以Cyt b和ATPase 6合并序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 Molecular phylogenetic trees based on the combined sequences of Cyt b and ATPase 6 genes

3 討論

中國(guó)大鯢遷徙能力差，對(duì)水環(huán)境的依賴性很大，且不同水系種群間的基因交流不太可能，部分地區(qū)種群可能形成獨(dú)特的種群遺傳特征。中國(guó)大鯢主要分布于23.5～35°N的區(qū)域，本研究中大鯢樣本采集于歷山地區(qū)35°12'N處。歷山作為現(xiàn)今中國(guó)大鯢分布的最北端，研究其種群結(jié)構(gòu)及遺傳特性對(duì)于大鯢種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要意義。本研究結(jié)果表明:2尾歷山大鯢基因序列在個(gè)別位點(diǎn)有地域特異性，歷山大鯢與四川、陜西樣本的遺傳距離較近，與廣西樣本的遺傳距離最遠(yuǎn)。分析不同來(lái)源16個(gè)樣品核苷酸序列的差異，所測(cè)ATPase 6序列變異率比Cyt b序列高，但兩基因序列堿基組成同樣表現(xiàn)出了鳥(niǎo)嘌呤的缺乏，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子第3位，且變異以轉(zhuǎn)換為主。本研究中雖然收集的大鯢樣品數(shù)量有限，只檢測(cè)了2段常用DNA分子標(biāo)記序列，但還是能夠說(shuō)明中國(guó)大鯢不同地理位置種群間存在遺傳差異，歷山野生大鯢種群具有一定的遺傳特征。Murphy等［11］在對(duì)中國(guó)大鯢mtDNA序列分析的基礎(chǔ)上，認(rèn)為安徽黃山大鯢為一單獨(dú)分支，具有獨(dú)特的遺傳特征，但沒(méi)有確定出三流域之間地理種群的親緣關(guān)系。本研究中，作者認(rèn)為長(zhǎng)江流域種群可能充當(dāng)了黃河流域種群與珠江流域種群的橋梁作用。

歷山地區(qū)大鯢分布比較集中，主要位于李家河上游部分溪流中。山西省曾于1984年對(duì)歷山地區(qū)大鯢資源進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大鯢主要分布于同善公社東北角和銅礦峪一帶。2010年作者對(duì)大鯢棲息地調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，銅礦峪地區(qū)由于銅礦的開(kāi)發(fā)，河道污染嚴(yán)重，大鯢已經(jīng)絕跡，另一主分布區(qū)西陽(yáng)河上游西哄哄段大鯢數(shù)量也急劇減少。因此，保護(hù)歷山野生大鯢資源刻不容緩。

目前，大鯢人工繁殖及規(guī)?；庇夹g(shù)已取得成功［18］，種群數(shù)量已有所恢復(fù)，但其種群多樣性短期內(nèi)仍難以有效恢復(fù)［19］。Lin 等［20］通過(guò) RAPD分析了大鯢親本及子二代的多樣性，發(fā)現(xiàn)子二代的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親本。因此，保護(hù)野生大鯢種群對(duì)于保護(hù)大鯢資源并有效利用其資源具有重要意義。歷山地區(qū)是野生大鯢分布區(qū)域中緯度最高的地域，其大鯢種群在中國(guó)大鯢資源中占有不可替代的重要位置。在有關(guān)部門的倡導(dǎo)與資助下，垣曲縣境內(nèi)成立了山西省首個(gè)大鯢保護(hù)繁育站，但由于資金、設(shè)施及配套管理措施不到位，尤其是專業(yè)技術(shù)人員的缺乏，工作難度較大，亟待多方的大力支持。

致謝:本研究得到了山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所、垣曲縣水利局和歷山大鯢保護(hù)繁育站的大力支持，在此表示感謝!

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