方珍珍，景宏麗，江育林，張利峰，張旻，李華

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023;2.天津農(nóng)學院水產(chǎn)科學系，天津300384;3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100029;4.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026)

草魚出血病是一種具高度傳染性和致死性的病毒性魚病，該病流行于中國各地草魚養(yǎng)殖區(qū)，尤以長江流域和廣東、廣西、福建最為普遍，死亡率高達80%，嚴重影響了草魚Ctenopharyngodon idellus養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。1972年首次報道該病，1978年確定為病毒病，1980年首次在病魚的頭腎切片中觀察到呈晶格狀排列的病毒粒子，1984年確定草魚出血病病原為呼腸孤病毒［1-2］。草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)是中國分離、鑒定的第一株水生動物病毒，對該病毒的形態(tài)學、生物學、流行病學、理化及分子生物學等方面已進行了系統(tǒng)的研究［3-8］。

草魚呼腸孤病毒的基因組由11個dsRNA片段組成，不同的毒株間病毒基因組的總分子質(zhì)量差異不大 (相對分子質(zhì)量約15×106)，但各片段分子質(zhì)量有所差異。近年來，方勤等［9］通過序列分析和三維結構研究表明，成熟的GCRV顆粒由7種結構蛋白和4種非結構蛋白組成，其中病毒蛋白VP5和VP7構成了病毒的外層衣殼組分。通過蛋白酶裂解試驗揭示了VP5和VP7在病毒感染及致病中起著不可替代的作用。此外，VP5還可進行構象的改變，其作用是保證膜穿透［10-12］，同時VP5也是GCRV的衣殼蛋白，可能具有較高的免疫原性。

關于草魚出血病的檢測，電鏡觀察是最直觀而有效的方法，在最初的研究中應用較多，但是存在著技術和儀器要求以及樣品制備復雜等問題［13］。分子檢測技術PCR方法雖然具有高靈敏度的優(yōu)點，但由于存在假陽性，在結果判定上容易出現(xiàn)不確定性，并且難以判斷是具有完整病毒粒子還是僅存在殘余的病毒核酸［14-16］。因此，用于抗原檢測的免疫學方法可以作為確診的重要依據(jù)。而免疫學方法的應用需要一定量的抗血清，通常采用滅活毒株免疫動物獲得免疫血清，但這種方法需要增殖大量的病毒并對其純化，血清生產(chǎn)成本高，過程復雜，制約了抗血清的大量獲得。本研究中，作者在對GCRV基因序列分析的基礎上，選擇病毒的外殼蛋白VP5基因進行表達載體的構建和蛋白表達，以期得到人工表達的病毒外殼蛋白，旨在為該病毒單克隆抗體和多克隆抗體的制備，以及免疫檢測試劑盒的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株和載體 毒株GCRV-873為中科院武漢病毒所贈送;pET-30α質(zhì)粒購自Novagen公司;大腸桿菌E.coli DH5α、大腸桿菌BL-21(DE3)、RNA提取試劑盒 (硅基質(zhì)膜吸附法)、Quant一步法RT-PCR試劑盒 (高效逆轉(zhuǎn)錄酶)、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根生化科技 (北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自NEB公司;蛋白預染Marker購自 Fermentas公司;Ni-NTA HisBind融合蛋白純化購自MERCK公司。

1.1.2 引物 根據(jù)GenBank中的序列(登錄號AF239175)設計引物GCRV-U和GCRV-D分別為5'GAGCTCGGACTTCGCACTCTCTCTACAATG3'，5'CTCGAG AA GTTCACGCGGGCATGGAAG 3'。上游引物引入SacⅠ位點，下游引物引入XhoⅠ位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GCRV-873病毒總RNA的提取和RTPCR擴增 使用RNA提取試劑盒提取總RNA。取總RNA 10 μL配制50 μL反應體系，進行 RTPCR擴增。反應條件:先在50℃下反轉(zhuǎn)錄30 min，再于94℃下預變性2 min;然后在94℃下變性1 min，在60℃下退火1 min，在72℃下延伸2 min，共進行35個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的亞克隆 取PCR回收產(chǎn)物用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，用10 g/L瓊脂糖凝膠回收目的片段;pET-30α質(zhì)粒同樣用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切、回收。取經(jīng)酶切處理的1 μL pET-30α質(zhì)粒、5 μL GCRV-VP5基因 PCR 產(chǎn)物、1 μL T4 DNA連接酶和1 μL 10×連接酶buffer，在16℃下連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性菌落克隆，陽性菌落經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定后，送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

1.2.3 重組大腸桿菌的誘導培養(yǎng)和目的蛋白的檢測 挑取測序驗證構建成功的pET-30α重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含卡那霉素 (Kan)的固體LB平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。分別挑取帶有重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單克隆菌落接種于3 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接種至50 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)至光密度值OD600nm=0.6。每個克隆選取一瓶，加入原始濃度為1 mol/L的IPTG培養(yǎng)液，至終濃度為1 mmol/L，并于37℃下誘導培養(yǎng)4 h，分別離心收集菌體并超聲破碎，將離心后的上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，凝膠用考馬斯亮藍染色。

1.2.4 包涵體的粗提和洗滌 取1 L菌液，參照《分子克隆實驗指南》［17］有關方法，以低速離心收集沉淀，將沉淀重懸于細胞裂解液 (50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中，用功率為400 W的超聲按照作用3 s、間隔3 s進行處理，直至菌液澄清。以4 000 g離心15 min，棄上清，收集沉淀，除去大部分可溶菌體蛋白。將沉淀于含有Triton-100的細胞裂解液中洗滌2～3次，進一步去除雜蛋白和雜質(zhì)。最后收集沉淀，于-20℃下保存。

1.2.5 融合蛋白的純化 將洗滌后的包涵體用含8 mol/L尿素的PBS緩沖液完全溶解，經(jīng)帶有Ni-NTA HisBind的樹脂混勻，用柱層析純化融合目的蛋白，用含4 mol/L尿素的透析液 (0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0)進行透析，然后逐步降低尿素濃度至零，透析48～60 h后，取10 μL進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 Western blotting分析 取純化后的融合蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜中，以質(zhì)量分數(shù)為10%的脫脂奶粉封閉過夜。次日進行Western blotting試驗，分別以His·Tag單克隆抗體和羊抗GCRV抗血清作為一抗，于37℃下孵育1 h，用1×PBST洗滌3次。加入用HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗鼠二抗和抗羊二抗，于37℃下孵育1 h，再用1×PBST洗滌3次，加入DAB顯色，用去離子水終止反應。

1.2.7 多克隆抗體的制備及抗體效價的檢測 將純化病毒和表達蛋白分別作為抗原免疫山羊，共免疫4次。第一次基礎免疫:抗原與弗氏完全佐劑按1∶1混合，皮下多點注射，免疫劑量為1 mg/只。一周后加強免疫一次:抗原與弗氏不完全佐劑按1∶1混合，皮下注射，免疫劑量為1 mg/只。之后每隔一周加強免疫一次，注射劑量加倍。4次免疫后采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測抗體效價。

2 結果

2.1 重組克隆的鑒定

從細胞培養(yǎng)的GCRV-873病毒懸液提取總RNA，通過RT-PCR擴增GCRV-VP5基因，得到約為2 005 bp的PCR產(chǎn)物 (圖1)。PCR產(chǎn)物克隆至pET-30α質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)中，挑取過夜生長的菌落，進行小量培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用SacⅠ和XhoⅠ做酶切鑒定，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可得到2 005 bp的DNA目的條帶 (圖2)，并鑒定為陽性重組質(zhì)粒，命名為pET-30α-GCRV-VP5。菌落經(jīng)PCR鑒定為陽性，顯示克隆成功。

圖1 GCRV-873病毒VP5基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of GCRV-873 strain VP5 gene

圖2 重組質(zhì)粒pET-30α-GCRV-VP5的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombination plasmid pET-30α-GCRV-VP5 by enzyme digestion

測序結果顯示，該基因序列與GenBank公布的AF239175相似性達99%，提示已成功構建了重組質(zhì)粒pET-30α-GCRV-VP5。

2.2 表達產(chǎn)物的可溶性分析

誘導表達后，細胞經(jīng)超聲處理，上清與沉淀分別進行SDS-PAGE。結果顯示，目的蛋白大部分在超聲后的沉淀中，提示表達產(chǎn)物主要以不可溶的包涵體形式存在(圖3(a))。

2.3 融合蛋白的純化

將包涵體用Ni-NTA HisBind樹脂將目的蛋白純化，透析后進行SDS-PAGE分析。結果顯示，可得到純度較高的蛋白，經(jīng)測定其質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL(圖3(b))。

2.4 重組蛋白的Western blotting鑒定

對純化后重組蛋白進行Western blotting檢測，結果顯示，以His·Tag單克隆抗體為抗體，在硝酸纖維素膜相對分子質(zhì)量為77 000處出現(xiàn)一特異性反應條帶(圖4(a))，同時以羊抗GCRV抗血清為抗體，也可出現(xiàn)相同分子質(zhì)量大小的特異性反應條帶(圖4(b))，證實了相對分子質(zhì)量為77 000處的條帶為含有目的蛋白的融合表達產(chǎn)物。

2.5 多克隆抗體的效價

分別用病毒和表達蛋白作為抗原，對免疫山羊4次后獲得的抗血清，用ELISA法測得抗體的效價均在10-4。表明兩種抗原均可誘導動物產(chǎn)生良好的體液免疫反應。

3 討論

本研究中對GCRV-VP5基因進行了人工表達，用表達的重組蛋白作為抗原，免疫動物并使之產(chǎn)生相應的抗體，表達的需要量較大，為此構建了原核表達體系。將RT-PCR擴增出的目的條帶連接到表達質(zhì)粒pET-30α中，構建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細胞中進行表達。經(jīng)過SDS-PAGE分析，誘導后重組菌在相對分子質(zhì)量約為77 000處出現(xiàn)一條蛋白條帶，提示感受態(tài)菌可能表達了含有目的蛋白的融合表達產(chǎn)物。經(jīng)Western blotting鑒定，該條帶可以與His·Tag抗體和羊抗GCRV抗血清特異性結合，表明在相對分子質(zhì)量為77 000處的條帶的抗原性和病毒蛋白的抗原性相似，也表明其中含有目的蛋白的融合表達產(chǎn)物。而利用pET-30α質(zhì)粒載體系統(tǒng)表達的外源基因，表達蛋白帶有6個組氨酸標記，因6×His很小，所以不會影響表達蛋白的結構和功能，無需用蛋白酶把6×His切除［18］。而且6×His免疫原性差，融合蛋白可直接用作抗原產(chǎn)生所需的抗體。

圖3 重組蛋白的表達和包涵體的洗滌及重組蛋白的純化Fig.3 Expression of recombinant proteins and washing，and purification of recombinant proteins

圖4 重組蛋白與His·Tag單克隆抗體、羊抗GCRV抗血清進行免疫印跡Fig.4 Western blot analysis by recombinant proteins with His·Tag monoclonal antibodies，and goat anti-GCRV serum

本研究中在37℃下誘導，對表達產(chǎn)物的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結果表明，該融合產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，是包涵體形成的原因之一［19］。但蛋白以包涵體形式出現(xiàn)，其蛋白的自然結構和抗原活性都會受到很大影響，為此進行了包涵體的洗滌、溶解、純化、復性。本試驗中首先通過物理方法超聲破碎對表達菌進行裂解。由于菌體及部分破碎的細胞膜及膜蛋白常常與包涵體粘連在一起，因此在溶解包涵體之前的洗滌非常重要。本研究中參照《分子克隆實驗指南》［17］對包涵體進行了洗滌，取得了較好的洗滌效果。對包涵體進行溶解純化后，如何將其轉(zhuǎn)化成有活性的蛋白，其中蛋白質(zhì)的復性是非常重要的一步。在實驗室中，一般采用傳統(tǒng)的稀釋和透析方法進行復性。由于多肽鏈之間的聚集容易造成蛋白質(zhì)沉淀，而蛋白質(zhì)的濃度是引起多肽鏈聚集的主要因素。通常蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度控制在0.1～1.0 mg/mL。變性蛋白經(jīng)過尿素處理至可溶以后，再逐漸滴加到復性液中使之復性。但如果加到復性液中的速度過快，就容易形成絮狀沉淀，這可能是蛋白重新凝聚的緣故［20］。為此，Mayer等［21］設計了一種緩慢透析法，用8 mol/L的尿素溶液作為起始透析液，然后逐漸稀釋降低透析外液的尿素濃度。變性劑濃度連續(xù)緩慢下降，有助于減少蛋白質(zhì)復性過程中沉淀的出現(xiàn)，提高活性蛋白質(zhì)的收率。因此，本研究中選擇透析復性，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，復性后離心僅有少量沉淀，復性效果較好。

本試驗中制備的兩種多克隆抗體均有較高的效價，且效價水平相差不大，說明兩種抗原均可刺激動物產(chǎn)生免疫學反應。對比而言，表達蛋白制備的多抗較病毒制備的多抗靈敏度和特異性要好一些。因此，表達的重組蛋白可以應用于ELISA等免疫學檢測方法的研究。重組蛋白的成功表達和復性為今后GCRV單克隆抗體的制備提供了較好的方法，也為進一步制備免疫學方面的檢測試劑盒研究工作提供了科學依據(jù)。

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