戴建清，曾志恒

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350001；2.福州百菇生物技術(shù)有限公司，福建 福州350014）

食用菌，俗稱蘑菇，是一類(lèi)具有肉質(zhì)、膠質(zhì)、木質(zhì)、革質(zhì)子實(shí)體，并具有食用價(jià)值的大型菌物，通常是指肉眼可見(jiàn)、可以用手采摘、大小到達(dá)厘米級(jí)、單個(gè)子實(shí)體重量為50 mg以上的大型菌物[1]。食用菌種類(lèi)較多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界共有野生食用菌2 000多種，中國(guó)就有981種，目前已開(kāi)發(fā)利用常見(jiàn)的約30多種[2]。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)和出口大國(guó)，2008年中國(guó)食用菌的年總量約為 (1×107)t，產(chǎn)值約為500億元，產(chǎn)量占世界總量的65%以上[2]。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的食用菌生產(chǎn)模式越來(lái)越不能滿足食用菌日益發(fā)展的要求。在食用菌產(chǎn)業(yè)中，菌種生產(chǎn)作為這一產(chǎn)業(yè)的首道工序，關(guān)系著這一產(chǎn)業(yè)的成敗，其重要性不言而喻。與固體菌種相比，液體菌種以其具有培養(yǎng)時(shí)間短、發(fā)菌快、菌齡整齊一致、接種方便等優(yōu)點(diǎn)，并有利于食用菌規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)，越來(lái)越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞，已成為當(dāng)前食用菌制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。因此，國(guó)內(nèi)外的食用菌研發(fā)機(jī)構(gòu)對(duì)利用液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行食用菌的工業(yè)化制種加大了投入和研發(fā)力度。

1 國(guó)內(nèi)外食用菌液體菌種研究現(xiàn)狀和生產(chǎn)應(yīng)用

食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)是綜合食用菌及工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的一門(mén)交叉學(xué)科[3]。據(jù)資料報(bào)道，1948年，最早利用食用菌液體發(fā)酵技術(shù)的是美國(guó)的Humfeld等對(duì)蘑菇進(jìn)行的液體深層發(fā)酵研究[4]，從此食用菌的發(fā)酵生產(chǎn)在世界范圍內(nèi)興起。1958年，美國(guó)液體深層發(fā)酵專家J.Szuecs利用發(fā)酵罐成功培養(yǎng)出多種食用菌菌絲體[5]，之后食用菌液體培養(yǎng)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外相繼出現(xiàn)。1960年代在日本，固體菌種稱之為“第一世代菌種”一直被廣泛使用。直至1999年，日本一家大型菇廠首次采用了在可動(dòng)發(fā)酵罐里培養(yǎng)菌種的韓國(guó)模式液體菌種系統(tǒng)（圖1），并稱之為“第二世代菌種”（圖2）。在中國(guó)第四屆蘑菇節(jié)，日本起源生物技術(shù)株式會(huì)社的小林恭久先生著重介紹了還原型液體菌種（圖4），稱之為“第三世代菌種”，它是把人工生產(chǎn)的還原型固體菌種塊粉碎后用無(wú)菌水稀釋而成的液體菌種，還原型固體菌種具有活力強(qiáng)，接種量大的特點(diǎn)，每1 200 mL菌種可擴(kuò)接10 000瓶（圖3）。目前，日本一些大型金針菇菌種中心開(kāi)始大規(guī)模地引進(jìn)這一技術(shù)，并已經(jīng)實(shí)用在金針菇和杏鮑菇的生產(chǎn)上。在國(guó)內(nèi)，1962年中國(guó)科學(xué)院植物生理研究所的陳聿美等對(duì)香菇、平菇、草菇等15種食用菌的深層培養(yǎng)進(jìn)行研究[6]。從此，有許多科研生產(chǎn)單位對(duì)多種食用菌進(jìn)行了液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究。但當(dāng)時(shí)主要研究靈芝、蜜環(huán)菌、銀耳等食用菌的液態(tài)發(fā)酵應(yīng)用醫(yī)藥工業(yè)和食品飲料工業(yè)。直至1987年，上海師范大學(xué)的楊慶堯等首次報(bào)道以液體菌種作為原種，合成顆?；蚬攘＞N作栽培種的蘑菇制種新工藝，整個(gè)制種工序歷時(shí)僅23 d～27 d，比舊工藝快3倍～4倍[7]。從此，食用菌液體培養(yǎng)制種的成功報(bào)道在國(guó)內(nèi)相繼出現(xiàn)。目前能用液體培養(yǎng)制種的食用菌有雙孢蘑菇、金針菇、杏鮑菇、香菇、猴頭菇、黑木耳、平菇等。但由于液體菌種對(duì)生產(chǎn)工藝及技術(shù)條件要求高，多數(shù)試驗(yàn)停留在搖瓶培養(yǎng)階段，并受資金和技術(shù)的限制，我國(guó)仍有相當(dāng)多食用菌生產(chǎn)企業(yè)和個(gè)人采用傳統(tǒng)固體菌種栽培模式。2009年，黃愛(ài)榮等[8]利用全自動(dòng)發(fā)酵罐對(duì)雙孢蘑菇As2796液體菌種的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，并對(duì)不同擴(kuò)增倍數(shù)的液體菌種的活力進(jìn)行了比較。2010年，沈敏等對(duì)杏鮑菇液體菌種進(jìn)行研發(fā)工作，并將液體菌種成功應(yīng)用在工廠化栽培中，實(shí)現(xiàn)了杏鮑菇工廠化栽培的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的目標(biāo)[9]。隨著工業(yè)化生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)管理方式組織食用菌生產(chǎn)的進(jìn)程不斷推進(jìn)，越來(lái)越多食用菌生產(chǎn)企業(yè)將液體菌種生產(chǎn)技術(shù)與工廠化栽培技術(shù)有機(jī)結(jié)合，來(lái)實(shí)現(xiàn)食用菌規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化的工廠化生產(chǎn)。

2 食用菌液體菌種制作工藝及關(guān)鍵技術(shù)

2.1 液體菌種制作主要設(shè)備

與固體制種比較，液體制種技術(shù)條件較高，所需的主要設(shè)備包括：液體培養(yǎng)基配制設(shè)備，包括電子稱、不銹鋼鍋、電磁爐和增壓泵（輸送培養(yǎng)基到發(fā)酵罐內(nèi)）等；搖瓶菌種培養(yǎng)設(shè)備，包括各種規(guī)格的錐形瓶、控溫旋轉(zhuǎn)式搖床等；液體菌種培養(yǎng)設(shè)備，包括發(fā)酵罐、空氣過(guò)濾裝置、溫度控制裝置、冷卻裝置、停電保護(hù)裝置、空氣壓縮機(jī)和輸送管道等；接種培養(yǎng)設(shè)備，包括接種針、液體菌種自動(dòng)接種器、接種箱、超凈工作臺(tái)和生化培養(yǎng)箱等。目前，全國(guó)生產(chǎn)液體菌種設(shè)備的企業(yè)有多家，有些設(shè)備可操作性強(qiáng)，有的可操作性較差，一般用戶技術(shù)不太熟練就容易造成失敗。根據(jù)李燦等[10]多年的液體菌種指導(dǎo)的實(shí)踐，一套優(yōu)良的液體制種設(shè)備要有良好的空氣過(guò)濾系統(tǒng)、靈敏的溫度控制系統(tǒng)、快速冷卻系統(tǒng)、停電保護(hù)裝置，耐高壓精加工的罐體等組成。液體制種利用的發(fā)酵罐僅僅是其中的一個(gè)主體設(shè)備，與其配套的接種槍等設(shè)備同等重要，當(dāng)進(jìn)入生產(chǎn)環(huán)節(jié)袋料接種時(shí)，需嚴(yán)格的無(wú)菌操作環(huán)境，才能保證栽培袋不受污染[11]。

圖1 韓式發(fā)酵罐

圖2 液體菌種

圖3還原型固體菌種

圖4還原型液體菌種

2.2 國(guó)內(nèi)液體菌種制作工藝

經(jīng)過(guò)幾十年的不斷改進(jìn)和完善，我國(guó)的食用菌液體菌種生產(chǎn)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。1989年，江蘇工學(xué)院沈光偉等[12]研制并應(yīng)用了成套的液體菌種生產(chǎn)裝置及配套的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了液體菌種的生產(chǎn)，液體菌種生產(chǎn)工藝經(jīng)科技人員的努力日臻成熟。目前，液體培養(yǎng)的菌種有作為原種或栽培種兩種制種工藝。作為原種是把液體培養(yǎng)的菌種作為中間種，接到栽培種的培養(yǎng)基上，通過(guò)培養(yǎng)，制成固體栽培種。楊慶堯報(bào)道的蘑菇液體--顆粒菌種屬于這種制種工藝。作為栽培種是把液體菌種直接接到栽培料上，通過(guò)培養(yǎng)收獲食用菌子實(shí)體。金針菇、平菇的液體菌種的制備屬于這種制種工藝。無(wú)論是以液體菌種作原種，還是以液體菌種作栽培種，主要取決于不同食用菌的生物學(xué)特性及栽培模式。

2.3 液體菌種制作關(guān)鍵技術(shù)

目前，食用菌的液體菌種的利用成為發(fā)展趨勢(shì)，但只有部分食用菌工廠化生產(chǎn)企業(yè)涉足液體菌種的生產(chǎn)，很多人對(duì)該技術(shù)缺乏深入了解，根據(jù)前人的生產(chǎn)實(shí)踐，總結(jié)了液體菌種制作關(guān)鍵技術(shù)有以下幾點(diǎn)：搖瓶菌種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，根據(jù)不同品種食用菌的生物學(xué)特性，以菌絲生物量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)或響應(yīng)面法，優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，確定最適碳源、氮源和pH值，以及裝液量、最佳培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)，經(jīng)2級(jí)~3級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，為進(jìn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)提供活力強(qiáng)的搖瓶菌種；液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝優(yōu)化；以菌絲生物量為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵罐接種量、裝液量、通氣量和發(fā)酵起始pH值的單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，并依據(jù)液體菌種的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，繪制生長(zhǎng)曲線，以菌絲體形態(tài)、生物量及pH值確定發(fā)酵終點(diǎn)；污染檢查，液體菌種一旦受到污染，如果使用會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，所以檢查污染是非常關(guān)鍵的步驟。通常采用先聞后看再取樣的方法進(jìn)行檢查，并配備顯微鏡進(jìn)行觀察。在無(wú)菌操作下，取樣接入空試管培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察；液體菌種制作設(shè)備，發(fā)酵罐是液體制種中的關(guān)鍵設(shè)備，其必須要求可操作性強(qiáng)，并具有良好的空氣過(guò)濾系統(tǒng)、靈敏的溫度控制系統(tǒng)、快速冷卻系統(tǒng)、停電保護(hù)裝置，耐高壓精加工的罐體等組成。此外，要求各個(gè)液體制種設(shè)備配套銜接，使整個(gè)液體制種工藝設(shè)計(jì)科學(xué)合理。

3 食用菌液體菌種制作存在的問(wèn)題

盡管我國(guó)的食用菌液體菌種生產(chǎn)已取得了很大進(jìn)步，但目前液體菌種制作過(guò)程中仍存在諸多問(wèn)題，使得液體制種技術(shù)得不到普及和推廣。食用菌液體菌種制種存在的問(wèn)題主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面[11]：食用菌液體制種設(shè)備有待改進(jìn)，發(fā)酵罐管路復(fù)雜，難以清洗，殘留發(fā)酵液成為發(fā)酵罐內(nèi)主要污染源之一，發(fā)酵罐內(nèi)加熱棒設(shè)計(jì)不科學(xué)等諸多問(wèn)題待進(jìn)一步改進(jìn)；液體接種相關(guān)設(shè)備不配套，難以發(fā)揮液體制種的效用。各個(gè)液體制種設(shè)備配套銜接，使整個(gè)液體制種工藝設(shè)計(jì)科學(xué)合理；液體制種操作技術(shù)人才貧乏，加大推廣難度。食用菌制種技術(shù)勞動(dòng)強(qiáng)度大，高學(xué)歷專業(yè)技術(shù)人才不愿進(jìn)入，制種是整個(gè)食用菌生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，高素質(zhì)人才的短缺阻礙了液體制種技術(shù)的推廣和發(fā)展；標(biāo)準(zhǔn)化的液體接種操作規(guī)程尚為空白。應(yīng)加快建立標(biāo)準(zhǔn)化的液體接種操作規(guī)程，過(guò)程設(shè)計(jì)盡量程式化，增強(qiáng)操作的規(guī)范性。各項(xiàng)操作調(diào)控也盡量實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，發(fā)酵管理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

4 國(guó)內(nèi)食用菌液體菌種發(fā)展趨勢(shì)

中國(guó)食用菌品種繁多，產(chǎn)量和種類(lèi)居世界首位。先進(jìn)的制種技術(shù)對(duì)我國(guó)食用菌的生產(chǎn)和國(guó)際貿(mào)易具有重要影響。當(dāng)前國(guó)際上食用菌制種行業(yè)已走上產(chǎn)業(yè)化、專業(yè)化、工廠化大規(guī)模生產(chǎn)的道路。液體菌種以其具有培養(yǎng)時(shí)間短、發(fā)菌快、菌齡整齊、接種方便等優(yōu)點(diǎn)，并有利于食用菌規(guī)?；⒅苣昊?、工廠化生產(chǎn)，使其越來(lái)越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞，已成為食用菌制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外食用菌液體菌種發(fā)展態(tài)勢(shì)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：發(fā)展多品種液體菌種，由于生產(chǎn)工藝及技術(shù)條件要求較高，并受資金的限制，我國(guó)具有規(guī)?；?、工廠化食用菌生產(chǎn)企業(yè)仍然以固體制種為主，液體制種的應(yīng)用只局限于杏鮑菇、金針菇和蟹味菇等品種[13]。為適應(yīng)國(guó)際市場(chǎng)需求，應(yīng)在穩(wěn)定發(fā)展現(xiàn)有常規(guī)種類(lèi)的液體制種的基礎(chǔ)上，同時(shí)適度發(fā)展各種珍稀菌種在液體菌種的開(kāi)發(fā)，進(jìn)一步的促進(jìn)我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；改進(jìn)液體制種設(shè)備[11]，改進(jìn)加熱系統(tǒng)、采氣系統(tǒng)，解決發(fā)酵罐罐壁和罐內(nèi)加熱不均勻造成滅菌不徹底，以及因采氣系統(tǒng)缺陷而造成大量污染的局面，采取適當(dāng)措施以穩(wěn)定罐內(nèi)溫度，使發(fā)酵罐體內(nèi)溫度均衡。比如用耐高溫透明塑料替代鋼管，以增加罐體內(nèi)的可視性，空氣導(dǎo)管應(yīng)該便于拆卸清洗，以方便觀察內(nèi)部菌絲的生長(zhǎng)情況，與發(fā)酵罐主體相關(guān)聯(lián)的接種槍等附屬設(shè)施應(yīng)協(xié)調(diào)配套；液體菌種作為原種與栽培種生產(chǎn)工藝配套銜接。目前，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所已建成國(guó)內(nèi)首個(gè)采用無(wú)菌透氣袋作包裝材料的蘑菇透氣袋栽培種生產(chǎn)線（圖5～圖7），配套以液體原種工藝和低溫冷藏工藝進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，該項(xiàng)技術(shù)通過(guò)福州百菇生物技術(shù)有限公司向國(guó)內(nèi)蘑菇栽培企業(yè)推廣，獲得良好效果；向工廠化、機(jī)械化和自動(dòng)化發(fā)展。近年來(lái)，隨著我國(guó)食用菌專業(yè)機(jī)械的不斷問(wèn)世和液體制種設(shè)備的不斷改進(jìn)，利用液體制種技術(shù)及相關(guān)配套設(shè)施，使得食用菌制種勞動(dòng)強(qiáng)度大大減輕，提高了制種效率和效益。

圖5透氣袋蘑菇栽培種生產(chǎn)線

圖6液體原種生產(chǎn)的新型透氣袋蘑菇栽培種

圖7 低溫冷藏的新型透氣袋蘑菇栽培種

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