朱向濤

(浙江農林大學，臨安，311300)

王 雁 彭鎮(zhèn)華

(國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所))

律春燕

(膠州市少海發(fā)展管理處)

鄭寶強

(國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所))

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)為芍藥科芍藥屬名貴觀賞和藥用木本花卉，花大而美，有“花中之王”的美譽［1］。牡丹的組織培養(yǎng)已經有大量研究［2-7］，但尚未建立起一套完整的再生體系。體細胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、繁殖速度快、結構完整、植株再生率高、不受季節(jié)影響等特點，是植物大規(guī)模無性繁殖的一種主要手段［8］，有關牡丹體細胞胚發(fā)生的研究較少，且體細胞胚誘導率較低［9-11］，對本研究材料‘鳳丹’來說，僅在周秀梅［12］論文中有所研究，但體胚誘導率較低，僅為12.5%。本研究以‘鳳丹’不同發(fā)育時期的合子胚為材料，通過調整培養(yǎng)過程中不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，研究適合牡丹體細胞胚發(fā)生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，建立牡丹體細胞胚發(fā)生體系，為牡丹體胚的產業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

根據(jù)‘鳳丹’花后天數(shù)，分別選取牡丹種子，采回后放入冰箱內4℃保存?zhèn)溆?。分別以種胚、子葉、胚軸為外植體，種子采自中國林業(yè)科學研究院花卉中心試驗基地。

無菌處理:牡丹種子剝去最外層表皮，用自來水沖洗2 h，洗去表面黏液，之后在超凈工作臺上用70%酒精滅菌30 s，無菌水沖洗3～5次，然后用2%Na-ClO滅菌20 min，無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干表面水分，之后用鑷子和解剖刀剝取幼胚接種到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。利用上述方法將胚接種在MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1上培養(yǎng)20 d左右，培養(yǎng)后切取胚軸和子葉作為外植體誘導體細胞胚。

分別用花后80、90、100、110、120 d 的牡丹種子種胚誘導體細胞胚，每個時期完成3次重復，采回外植體后立即進行滅菌接種，先后分5次完成試驗。

利用種胚、胚軸、子葉等不同外植體對體胚進行誘導，研究不同外植體對體胚誘導的影響，每種外植體完成3次重復，種胚培養(yǎng)如上述方法進行，胚軸和子葉培養(yǎng)在種胚培養(yǎng)20 d后分別獲取進行試驗。

利用0、30、60、90、120 g·L-1等不同質量濃度蔗糖浸泡種胚2 h，滅菌后接種到培養(yǎng)基上，觀察不同蔗糖質量濃度處理對體胚誘導的影響，每個質量濃度完成3次重復。

采用3因素3水平的正交試驗設計(表1)，每個培養(yǎng)基組合完成3個重復，用花后110 d的種胚為外植體。每種培養(yǎng)基加入蔗糖30g·L-1，瓊脂7 g·L-1。

表1 正交試驗設計

培養(yǎng)基配制與滅菌:種胚發(fā)育時期、不同外植體、不同質量濃度蔗糖等因素對體胚誘導影響的研究均接種在 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30.0 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)20 d后轉到光暗交替(光照∶黑暗=12 h∶12 h)條件下培養(yǎng)，接種后70 d觀察試驗結果。所有培養(yǎng)基的pH值為5.6～5.8。

培養(yǎng)條件及培養(yǎng)過程:中國林業(yè)科學研究院花卉中心組培室，溫度20～25℃，光暗交替條件下，光照強度為 30～40 μmol·m-2·s-1。剛接種后在黑暗條件下培養(yǎng)20 d，之后轉入光暗交替條件下進行培養(yǎng)。每周觀察1次種胚的生長情況，及時剔除污染植株并記錄。每隔30 d轉接1次。

培養(yǎng)1周后觀察外植體污染情況，記錄數(shù)據(jù)，計算污染率和褐化率，誘導70 d后統(tǒng)計產生體細胞胚的外植體的數(shù)目，統(tǒng)計體細胞胚誘導率，所有數(shù)據(jù)利用Excel進行統(tǒng)計，利用spss17.0針對胚發(fā)育時期、不同外植體、蔗糖處理不同時間等因素對體細胞胚發(fā)生的影響進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)育時期對‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

不同發(fā)育時期種胚的發(fā)育情況不同，從表2可以看出，部分種胚接種到培養(yǎng)基后無明顯生長，保持原有胚的形態(tài)不變，隨著種胚成熟度的增加，無生長的現(xiàn)象逐漸降低，在花后120 d和花后110 d種胚無生長現(xiàn)象較低。污染數(shù)量隨生長期延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，花后80 d的外植體污染數(shù)最多，而花后120 d的外植體無污染。不同時期種胚生長的部位不同，隨著種胚成熟度的增加，胚根伸長的個數(shù)都有所增加，在花后110 d胚根伸長數(shù)達到最大。而在花后80 d，胚根伸長數(shù)最少。子葉生長數(shù)量隨著花后時間的延長而呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，在花后110 d子葉生長數(shù)達到最大，而花后80 d子葉生長數(shù)最小。體胚誘導數(shù)隨著花后生長時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在花后110 d達到最高，誘導數(shù)為13.00個，而在花后80 d體胚誘導數(shù)僅為5.00個?？梢婓w胚誘導選擇發(fā)育時期在花后110 d的種胚誘導效果最好，體胚發(fā)生率最高，為33.00%。每個發(fā)育時期都能誘導出體胚，但不同時期誘導率有所差異。

表2 合子胚的發(fā)育時期對‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

方差分析可以看出，體胚發(fā)生率與發(fā)育時期具有一定的相關性，體胚發(fā)生率隨著種胚成熟度的增加而增加，在花后100、110、120 d 3種成熟度體胚誘導率沒有顯著性差異，而花后80、90 d體胚發(fā)生率差異性不顯著，但花后80 d和90 d與其他3個時期體胚發(fā)生率差異性顯著。從表2可以看出，花后100 d為體細胞胚誘導的界限，體細胞胚發(fā)生率在100 d前后呈現(xiàn)顯著性差異，因此，在體細胞胚誘導過程中，選擇花后100 d以后的種胚更有利于體細胞胚發(fā)生，而相比較而言，110 d的種胚誘導體細胞胚的個數(shù)最多，因此，選擇花后110 d的種胚最好。

2.2 外植體類型對牡丹‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

外植體類型不同體胚誘導效果有所不同，總體上來看，利用種胚、胚軸和子葉均能誘導出體細胞胚，但誘導率差異顯著(表3)。

表3 外植體類型對‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

從表3可以看出，3種不同的外植體類型，體胚誘導率有所不同，總體上看，種胚的體胚誘導率最高，而胚軸的誘導率次之，子葉的誘導率最低，最高誘導率為33.00%，而最低的誘導率為8.00%。方差分析可以看出，種胚的體胚誘導率與其他2種外植體的差異顯著，而胚軸和子葉的體胚誘導率差異不顯著。在利用種胚誘導體細胞胚的過程中，利用種胚直接誘導要好于利用胚軸和子葉進行誘導。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，種胚在產生體細胞胚的過程中會發(fā)生顏色和形態(tài)的變化，最初將胚接種在培養(yǎng)基上時，胚呈現(xiàn)白色，2片小子葉緊密結合(圖1A)，之后胚2片小子葉開始慢慢開口(圖1B)，此時，胚顏色仍為白色，之后在培養(yǎng)基中營養(yǎng)的作用下，胚的體積逐漸增加，子葉開始慢慢長大，而胚根部位慢慢變粗，整個胚的顏色仍為白色，但顏色稍微加深，呈現(xiàn)乳白色(圖1C)，之后，隨著生長子葉的邊緣呈現(xiàn)淺紅色斑點，而在子葉的基部呈現(xiàn)淺綠色，整個胚呈現(xiàn)淡黃色(圖1D-E)。之后種胚的子葉部分開始變綠，而胚軸部分只是增粗，顏色未發(fā)生變化，仍然為白色，子葉不斷伸長，生長到一定程度后，停止伸長靠近培養(yǎng)基的一片子葉生長緩慢，遠離培養(yǎng)基的一片子葉生長較快，胚基部出現(xiàn)淺紅色或白色透明愈傷組織(圖1F)，此時可以進行胚軸和子葉分離分別培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，在胚軸部位開始出現(xiàn)體細胞胚的結構(圖1G-H)。對種胚經過20 d培養(yǎng)后形成的組織(圖1I)進行切割，將胚軸和子葉分開培養(yǎng)，誘導體細胞胚。結果表明，胚軸和子葉在接種到誘導培養(yǎng)基上后，容易形成愈傷組織(圖1J)，通過愈傷組織誘導進一步形成體細胞胚(圖1K-L)。

2.3 不同質量濃度蔗糖預處理對牡丹體細胞胚發(fā)生的影響

從表4可以看出，對照試驗的體細胞胚發(fā)生率較低，隨蔗糖質量濃度的提高，體細胞胚的誘導率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在質量濃度為90 g·L-1時，體細胞胚的發(fā)生率達到最高的38.00%，而未經蔗糖處理的體細胞胚的發(fā)生率為32.50%，方差分析可以看出，各種質量濃度的蔗糖處理體細胞胚發(fā)生率的差異不顯著。但可以看出利用蔗糖預處理要比沒有經過預處理的效果要好。因此，利用花后110 d的種胚誘導體細胞胚時，最好用90 g·L-1的蔗糖溶液處理2 h后再進行接種，有利于促進體細胞胚的產生。

2.4 培養(yǎng)基類型對體細胞胚誘導的影響

從表5中可以看出，所有培養(yǎng)基上都能誘導出體細胞胚，但是不同培養(yǎng)基誘導體細胞胚的數(shù)量不同，誘導率差異較大，總體上看，2號培養(yǎng)基誘導效果最好，體胚誘導率達到38.33%，其次是3號培養(yǎng)基。而7號培養(yǎng)基的誘導率最低，為15.83%。從方差分析可以看出，2號培養(yǎng)基與其他各培養(yǎng)基差異顯著。因此，2號培養(yǎng)基 MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1是最佳培養(yǎng)基。其他各個培養(yǎng)基之間差異性不顯著。

表4 不同質量濃度蔗糖預處理對‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

表5 不同誘導培養(yǎng)基對牡丹‘鳳丹’體胚發(fā)生的影響

表6 各因素極差分析

從各因素極差分析表(表6)中可以看出，對于體細胞胚誘導率，3因素中極差最大的是A(培養(yǎng)基)因素，為0.102，因此，為主要影響因素，而 B(2，4-D)為次要影響因素，極差最小的是C(6-BA)，為0.036，影響因素效果最小。所以，不同培養(yǎng)基對牡丹體細胞胚誘導的影響效果最大，而影響因素最小的是植物激素6-BA。從最大值上看，A因素的第1水平、B因素的第2水平和C因素的第2水平值最大，從而得出，各種因素的最優(yōu)組合為A1B2C2。即各種因素的最佳組合是MS+2，4-D 2.0 mg·L+6-BA 2.0 mg·L-1，此組合為2號培養(yǎng)基組合。

對不同培養(yǎng)基的方差分析可以看出，3種培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基是最好的培養(yǎng)基，而DKW和WPM比MS效果稍差，且兩者差異不顯著，而MS與后2種培養(yǎng)基差異性極顯著。2，4-D的不同質量濃度中，隨著質量濃度的提高，體胚誘導率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在質量濃度為2.0 mg·L 時效果最好，與其他2個質量濃度存在極顯著差異。而6-BA的質量濃度是3個影響因素中影響最小的，但是在不同質量濃度的變化中依然有差異，在質量濃度為2.0 mg·L-1時效果最好，與其他2個質量濃度存在極顯著差異。

圖1 體細胞胚形成過程

3 結論與討論

試驗結果表明，3種外植體中，種胚的誘導率最高，是最適合誘導體細胞胚的外植體。有關牡丹組的體細胞胚誘導前人也有研究，何桂梅［13］利用‘連鶴’‘島錦’花后70 d的胚進行體細胞胚的誘導，誘導率均在30%以下，而利用‘鳳丹’誘導體細胞胚誘導率僅為10%，本試驗結果誘導率更高。

Shin J H et al. 利用芍藥的種胚在常規(guī)培養(yǎng)基MS上預培養(yǎng)后，取子葉做外植體，在不同的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得了不同的誘導效果。不同的培養(yǎng)基對子葉誘導效果有所不同，誘導率也有較大差異，因此，針對不同的外植體采用不同的植物激素和基本培養(yǎng)基組合，篩選合適的培養(yǎng)基是有必要的。

利用質量濃度為90 g·L-1的蔗糖溶液處理種胚2 h，體細胞胚誘導效果最好。前人有多次利用蔗糖預處理外植體而提高體細胞胚誘導率的研究，Biahoua A et al.［15］研究不同類型的糖對歐洲衛(wèi)矛體細胞胚誘導的影響表明，蔗糖作為重要的滲透調節(jié)物對體細胞胚的誘導和發(fā)育都有重要作用。Zhou S J et al.［16］對北美人參進行蔗糖預處理，能夠提高體細胞胚誘導率，減少畸形胚發(fā)生的概率，主要原因可能是蔗糖處理后的高滲透壓使細胞質壁分離現(xiàn)象發(fā)生，從而促進體細胞胚的產生，具體原因有待進一步研究。而 Sujatha M et al.［17］對向日葵的體胚發(fā)生研究也發(fā)現(xiàn)，隨蔗糖質量濃度升高，體胚誘導率提高，以質量濃度為120～210 g·L-1的誘導率最高。對向日葵體胚分化最合適的蔗糖質量濃度是120～180 g·L-1，高于 180 g·L-1或低于 120 g·L-1的體胚均發(fā)育慢。達克東等［18］對蘋果離體葉片進行體細胞胚誘導認為，在碳源供應充足的情況下，適當降低蔗糖質量濃度有利于直接體胚的發(fā)生。由前人研究可以看出，不同的植物對蔗糖處理的反應不同，本試驗結果表明，利用質量濃度為90 g·L-1的蔗糖處理浸泡牡丹種胚2 h對體細胞胚誘導效果最好。

幾種培養(yǎng)基中，MS是最適合誘導體細胞胚的培養(yǎng)基。WPM培養(yǎng)基和DKW培養(yǎng)基是中等養(yǎng)分的培養(yǎng)基，其中NH4NO3的質量濃度較低，是適合木本植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。從試驗結果來看，后2種培養(yǎng)基對牡丹體細胞胚的誘導作用不理想，這說明牡丹體細胞胚培養(yǎng)可能需要高質量濃度的NH4NO3，但是高質量濃度的NH4NO3不利于培養(yǎng)外植體的酚類物質的擴散，這可能是在MS培養(yǎng)基上褐化相對嚴重的原因，尤其是在子葉和胚軸培養(yǎng)上，效果更明顯，在完整體胚的培養(yǎng)上，由于沒有對外植體進行切割，所以褐化的情況較少。

本試驗以2，4-D和6-BA2種植物生長調節(jié)物質為基礎，按照不同質量濃度梯度進行設計，均誘導產生了體細胞胚，但誘導率有差異，試驗結果表明，MS培養(yǎng)基是合適的培養(yǎng)基，而在2種植物生長調節(jié)物質質量濃度均為2.0 mg·L-1時，體胚誘導率最高。

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