徐 琦，程路峰，孟 巖，付 偉，楊 昭，丁劍冰*，羅 莉*

(新疆醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站;3.第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，新疆烏魯木齊830011)

濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh細(xì)胞)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的，真正意義上輔助B細(xì)胞功能的T細(xì)胞亞群，其輔助B細(xì)胞活化、增殖、分化和分泌免疫球蛋白［1］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)中，B細(xì)胞分泌大量高親和力抗體可誘發(fā)炎性反應(yīng)，致關(guān)節(jié)損傷［2］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)RA患者外周血Tfh細(xì)胞表型及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)，探討其與初發(fā)性RA發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及主要試劑

1.1.1 研究對(duì)象:RA組:新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科初次就診患者，符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組:為健康志愿者。各組均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑:FITC標(biāo)記的抗CXCR5，CD3抗體;PE標(biāo)記的抗CD8、CD3抗體;PerCP標(biāo)記的抗CD4抗體、PE-cy7標(biāo)記的抗 ICOS抗體以及同型對(duì)照(Becton Dickinson公司)。ELISA試劑盒(R＆D公司)。

1.2 免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):抗凝外周血100 μL，分別加入FITC標(biāo)記的抗CXCR5，PE標(biāo)記的抗CD3，PerCP標(biāo)記的抗CD4，PE-cy7標(biāo)記的抗 ICOS抗體各20 μL或者 FITC標(biāo)記的CD3，PE標(biāo)記的 CD8和PerCP標(biāo)記的 CD4抗體各20 μL，按規(guī)程操作。分析Th/Tc細(xì)胞，先以CD3+細(xì)胞設(shè)門分群后，分析CD4+、CD8+細(xì)胞百分率(圖1)。Tfh細(xì)胞分析，以FSC/SSC設(shè)門，得到CD3+CD4+細(xì)胞，進(jìn)而分析ICOS和CXCR5的表達(dá)(圖2)。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè):按照ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同指標(biāo)之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 RA組和對(duì)照組Th/Tc細(xì)胞、CD3+CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞百分率比較:RA組CD3+CD4+T細(xì)胞百分率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但 RA組 Th/Tc的比值低于對(duì)照組(P＜0.05)。RA患者CD3+CD4+CXCR5+Tfh的數(shù)量與正常對(duì)照相比較明顯增多(P＜0.05)(表1);CD3+CD4+ICOS+T細(xì)胞數(shù)量在患有RA后未見(jiàn)明顯增加，但CD3+CD4+ICOS+CXCR5+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。

2.2 細(xì)胞因子水平的比較:RA組IL-21和TGF-β水平分別為512.80±79.83 ng/L和659.13±184.20 ng/L，顯著高于對(duì)照組的340.24±45.05 ng/L和401.17±139.64 ng/L(P＜0.01);IL-4水平由對(duì)照組的680±76.83 ng/L降至RA組的320±56.83 ng/L(P＜0.01)。

表1 RA組和對(duì)照組T細(xì)胞亞群的比較Table 1 Comparison of T cell subset between control and RA group

2.3 RA患者外周血Tfh及細(xì)胞因子與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析:RA患者Tfh細(xì)胞百分率、IL-21水平與疾病DAS28評(píng)分、ESR、CRP、CCP 和 RF 正相關(guān)(r分別為 0.67，0.49，0.38，0.21和0.59，P＜0.05)，與疾病的病程及關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)無(wú)相關(guān)性。RA患者TGF-β水平升高而IL-4水平降低，但兩者與疾病活動(dòng)度均無(wú)相關(guān)性。

3 討論

RA患者存在細(xì)胞/體液免疫功能的紊亂，活化Th1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如IL-2等可以促進(jìn)CD8+Tc細(xì)胞的增殖，使臨床RA患者外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T細(xì)胞比例失衡，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)。同時(shí)，由于Th2細(xì)胞功能的抑制，導(dǎo)致血清中IL-4水平的降低，對(duì)IL-21促進(jìn)B細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體拮抗作用的減弱會(huì)進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)。另外，由于Tfh細(xì)胞的比例增加，可促進(jìn)IL-21的產(chǎn)生，并刺激B細(xì)胞活化，加之TGF-β的協(xié)同作用，可能導(dǎo)致了機(jī)體分泌病理性自身抗體，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)。由于IL-21還可以來(lái)源于的Th17，因此IL-21的升高，還應(yīng)考慮Th17的作用［3］。本研究?jī)H分析RA患者外周血中Tfh細(xì)胞和IL-21的水平，并沒(méi)有對(duì)RA患者體內(nèi)Tfh細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，檢測(cè)其分泌IL-21的能力。因此對(duì)RA患者體內(nèi)T細(xì)胞亞群的失調(diào)及相關(guān)細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］Ma CS，Deenick EK，Batten M，et al．The origins，function，and regulation of T follicular helper cells［J］．J Exp Med，2012，209:1241－1253．

［2］Leandro MJ，Becerra-Fernandez E．B-cell therapies in established rheumatoid arthritis［J］．Best Pract Res Clin Rheumatol．2011，25:535 －548．

［3］Lina C，Conghua W，Nan L，et al．Combined treatment of etanercept and MTX reverses Th1/Th2，Th17/Treg imbalance in patients with rheumatoid arthritis［J］．J Clin Immunol，2011，31:596 －605．