郝亞寧，駱文龍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶400010)

面神經(jīng)作為一條重要的周圍神經(jīng)，主要功能是支配面部肌肉的運(yùn)動(dòng)。外傷、鄰近組織感染、腦血管意外及醫(yī)源性損傷都可能損傷面神經(jīng)。近幾年諸多學(xué)者對(duì)面神經(jīng)損傷的修復(fù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。由于基因治療能在分子水平上糾正疾病的發(fā)病過(guò)程，因此在面神經(jīng)損傷的防治上有較好的應(yīng)用前景。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)對(duì)感覺神經(jīng)［1］、副交感［2］及交感神經(jīng)［3－4］，特別是對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)［5－6］的發(fā)育、軸索生長(zhǎng)都有一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性作用和導(dǎo)向作用。超聲輻照微泡能將目的基因轉(zhuǎn)入各種靶細(xì)胞和靶組織，但它在面神經(jīng)損傷修復(fù)的作用研究，尚未見國(guó)內(nèi)外報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超聲微泡介導(dǎo)HGF基因轉(zhuǎn)染損傷后的面神經(jīng)，觀察HGF的表達(dá)及受損面神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)電位波幅、潛伏期等參數(shù)，探討該方法的有效性，為面神經(jīng)損傷的修復(fù)提供一種新型、高效、安全的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，40只，雌雄不限，體質(zhì)量200～250g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0001。

1.2 質(zhì)粒的提取

HGF菌液由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬二院肝病研究治療中心提供，HGF經(jīng)大腸埃希氏菌擴(kuò)增16 h后，按質(zhì)粒大量抽提試劑盒 (Omega公司)說(shuō)明提取。提取純化的HGF經(jīng)酶切電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為1 g/L。

1.3 試劑

Trizol試劑，兔抗鼠HGF多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體，羊抗兔IgG，化學(xué)發(fā)光試劑，(武漢谷歌生物科技有限公司);脂質(zhì)微泡，(重醫(yī)附二院超聲影像學(xué)研究所提供)白色凍干粉末狀。使用時(shí)將2 mL 0.9%氯化鈉注射液注入瓶中，振蕩混勻，微泡濃度為(0.5～1)×108個(gè)/mL，微泡直徑為3 ～5 μm。

1.4 動(dòng)物模型的制作

5%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠并仰臥位固定，再以5%利多卡因局部追加麻醉。在手術(shù)顯微鏡下切開右側(cè)顳骨骨泡，用鉆磨開鐙骨肌支面神經(jīng)骨管3 mm左右，蚊式鉗鉗夾面神經(jīng)干長(zhǎng)約2 mm，力量為三扣，持續(xù)60 s，松開30 s，再鉗夾60 s，手術(shù)顯微鏡觀察面神經(jīng)損傷程度為束膜性神經(jīng)中斷，符合 Sunderland損傷Ⅳ度［7］.

1.5 脂質(zhì)微泡與HGF基因的結(jié)合

用一次性注射器取2 mL 0.9%氯化鈉注射液，注入微泡凍干粉瓶中，充分搖勻;取含HGF基因溶液0.5 mL(質(zhì)粒濃度為1 g/L)，加入微泡瓶中，搖勻后室溫下靜置30 min，使之充分黏附在微泡表面，該混合液中質(zhì)粒濃度為0.2 g/L。

1.6 動(dòng)物分組及給藥

模型制作成功后，將大鼠隨機(jī)分成4組，A組:單純手術(shù)組(PBS);B組:HGF+微泡組;C組:HGF+超聲組;D組:HGF+超聲+微泡組，每組10只。D組經(jīng)股靜脈注入載基因微泡溶液1 mL(含0.2 mg HGF)，再用超聲轉(zhuǎn)染儀，頻率1 MHz，功率0.75 W/cm2，緊貼面神經(jīng)受損部位進(jìn)行體外照射，照射10 s，間隔10 s，共2 min;C組經(jīng)股靜脈插管注入1 mL含0.2 mg HGF溶液，同樣采用上述超聲參數(shù)，B組經(jīng)股靜脈輸入同等劑量的載基因微泡，不用超聲觸發(fā);A組輸入1 mL PBS作為對(duì)照。

1.7 標(biāo)本采集

基因轉(zhuǎn)染后28 d，再以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。打開胸腔后，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈插管，剪開右心耳。迅速灌注0.9%NaCI約300 mL至從右心耳流出的血液完全變清，再灌注4%多聚甲醛約250 mL，先快后慢，致動(dòng)物四肢僵硬。切取吻合處神經(jīng)組織1 cm×1 cm，用于Western blot和RT-PCR檢測(cè)。

1.8 神經(jīng)電生理學(xué)檢測(cè)

采用BL-6420C生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)，將自制的針灸針電極作為刺激電極，兩極間的距離約為9 mm。記錄電極為針灸針(經(jīng)氯化銀鍍銀處理)雙極記錄電極?；蜣D(zhuǎn)染后28 d檢測(cè):常規(guī)10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，將針灸針刺激電極分別插至神經(jīng)干術(shù)后處的中樞端和外周端的肌肉，盡量將刺激電極靠近神經(jīng)，再將記錄電極插進(jìn)受面神經(jīng)支配的面頰肌，插入深度約為3～5 mm，兩電極間距離約為4～6 mm。刺激方式為正方波刺激(頻率60 Hz、波寬1 ms)，刺激電流從0 mA開始，至出現(xiàn)動(dòng)作電位。測(cè)定面神經(jīng)傳導(dǎo)速度(nerve conduction velocity，NCV)、潛伏期(Latency)及動(dòng)作電位的波幅(Amplitude)。

1.9 大鼠吻合處神經(jīng)組織中HGF基因mRNA轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)

采用RT-PCR法，根據(jù)GenBank中登錄的HGF(NM 017017)基因設(shè)計(jì)引物，正向序列:5'-GCTACA CAGGGAATCCTCTCG-3'，反向序列:5'-CGTTTCTCC TCGCCTCTCTC-3'，擴(kuò)增片段大小334 bp;內(nèi)參β-actin(NM 031144)正向序列:5'-CGTTGACATCCG TAAAGACCTC-3'，反向序列:5'-TAGGAGCCAGGG CAGTAATCT-3'，擴(kuò)增片段大小110 bp，引物由武漢谷歌生物科技有限公司合成。用Trizol試劑提取吻合處神經(jīng)組織RNA，合成cDNA第一鏈，再以其為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃ 30 s，54℃，30 s，72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)。mRNA水平用β-actin作為內(nèi)標(biāo)，以擴(kuò)增倍數(shù)=2－△△CT表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.1 0 大鼠吻合處神經(jīng)組織中HGF蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法，按100 mg組織:1 mL細(xì)胞裂解液的比例，4℃冰浴勻漿，提取總蛋白。用核酸蛋白定量?jī)x進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用封閉液(5%的脫脂奶粉)室溫封閉2 h;加入兔抗鼠HGF多克隆抗體和兔抗鼠 β-actin多克隆抗體(1∶200稀釋)，37℃孵育2 h;PBST洗膜，加入羊抗兔 IgG(1∶400稀釋)，37℃孵育2 h;化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)約2 min，發(fā)光成像儀呈像并測(cè)定條帶吸光度值。以目的條帶和內(nèi)參條帶吸光度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.1 1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)組做10個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，通過(guò) SPSS18.0軟件，采用多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較的q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

各組大鼠基因轉(zhuǎn)染后無(wú)一例死亡，手術(shù)切口一期愈合。術(shù)后1 d，各組動(dòng)物均有飲食下降、精神萎靡，右側(cè)面神經(jīng)受損后，胡須集中伸直，不能擺動(dòng)，鼻尖偏向左側(cè)，表現(xiàn)為完全性面癱。傷后10 d，各組大鼠情況沒(méi)有明顯好轉(zhuǎn)。傷后20 d，A、B、C組情況沒(méi)有顯著改變。D組大鼠右側(cè)胡須仍集中倒?fàn)睿倭亢氂屑?xì)微的擺動(dòng)，鼻尖仍向左偏斜。傷后28 d，A、B、C組大鼠雖然有明顯的改變，但沒(méi)有完全恢復(fù)。D組大鼠右側(cè)胡須大部分向前豎起，可見節(jié)律性擺動(dòng)，鼻尖居正中，大鼠右眼可以閉合。局部皮膚紅腫消退，感覺障礙，肌肉萎縮也較其余3組輕。

2.2 神經(jīng)電生理檢測(cè)

D組面神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)電位波幅明顯高于其余3組，潛伏期明顯低于其余3組(P＜0.05)。C組面神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)電位波幅明顯高于A、B兩組(表1)

表1 28 d后各組大鼠面神經(jīng)傳導(dǎo)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of facial nerve conduction indices among 4 groups 28 day after(x ± s，n=10)

2.3 各組大鼠吻合處神經(jīng)組織中HGF基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

D組損傷面神經(jīng)中HGF mRNA表達(dá)量明顯高于A、B、C組(P＜0.05)。C組損傷面神經(jīng)中HGF mRNA表達(dá)量明顯高于A、B組(P＜0.05)(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)大鼠HGF mRNA的表達(dá)Fig 1 HGF mRNA expression in rat was detected by real-time RT-PCR(x ± s，n=10)

2.4 各組大鼠吻合處神經(jīng)組織中HGF蛋白的表達(dá)水平

D組損傷面神經(jīng)中HGF蛋白表達(dá)量明顯高于A、B、C組(P＜0.05)。C組損傷面神經(jīng)中HGF蛋白表達(dá)量明顯高于A、B組(P＜0.05)(圖2，3)。

3 討論

基因治療主要目的是糾正基因水平上蛋白質(zhì)異常表達(dá)，通過(guò)基因治療方式導(dǎo)入神經(jīng)生長(zhǎng)因子的目的基因，使已降低的神經(jīng)生長(zhǎng)因子恢復(fù)到正常水平［8］。目前將外源基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的載體主要有病毒載體與非病毒載體。病毒載體效率高，但細(xì)胞毒性高、免疫原性強(qiáng);非病毒類載體較安全，但效率低［9］。因此選擇一個(gè)合理、安全及高效的給藥方式尤為重要。

本研究以HGF作為治療基因，采用超聲靶向破壞微泡技術(shù)將HGF轉(zhuǎn)染入受損面神經(jīng)周圍。微泡造影劑已被證明是一種新型、安全及高效的基因載體。當(dāng)微泡造影劑被注射到靜脈后，微泡造影劑會(huì)到達(dá)受損面神經(jīng)局部。此時(shí)在靶區(qū)給予一定強(qiáng)度和頻率的超聲輻照，受損面神經(jīng)周圍的微泡會(huì)破裂，從而釋放出HGF基因并通過(guò)細(xì)胞膜產(chǎn)生的小孔進(jìn)入細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。從結(jié)果可以得出，D組大鼠無(wú)論是觸須擺動(dòng)、鼻尖位置還是能否完全閉眼均明顯優(yōu)于其他3組。D組大鼠面神經(jīng)傳導(dǎo)速度、誘發(fā)電位波幅以及潛伏期明顯優(yōu)于其他3組，D組HGF蛋白及mRNA的表達(dá)量也顯著高于A、B、C組，說(shuō)明脂質(zhì)微泡能有效的與目的基因相結(jié)合，在一定頻率及強(qiáng)度超聲的作用下，能將目的基因轉(zhuǎn)染入受損的面神經(jīng)，為建立修復(fù)損傷面神經(jīng)的微環(huán)境提供安全有效的保障。此外，C組與A、B兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也有顯著差異，說(shuō)明C組也可以將HGF轉(zhuǎn)染入受損面神經(jīng)周圍，這是因?yàn)槌曌陨砭哂械臋C(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)能將HGF基因轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞或靶組織，只是相比D組的轉(zhuǎn)染效率要弱。這是因?yàn)檩d基因微泡在一定頻率和強(qiáng)度超聲作用下破裂，產(chǎn)生的空化效應(yīng)所致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明超聲微泡可以提高基因的轉(zhuǎn)染效率，從而驗(yàn)證了超聲微泡介導(dǎo)HGF轉(zhuǎn)染的潛在應(yīng)用價(jià)值，它能夠作為一種有效的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，為面神經(jīng)損傷的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Zheng LF，Wang R，Yu QP，et al．Expression of HGF/c-

Met is dynamically regulated in the dorsal root ganglions and spinal cord of adult rats following sciatic nerve ligation［J］．Neurosignals，2010，18:49 －56．

［2］Hobara N，Yoshida N，Goda M，et al．Neurotrophic effect of hepatic growth factor(HGF)on reinnervation of perivas-cular calcitonin gene-related peptide(CGRP)-containing nerves following phenol-induced nerve injury in the rat mesenteric artery［J］．J Pharmacol Sci，2008，108:495 － 504．

［3］Kato N，Nemoto K，Nakanishi K，et al．Nonviral HVJ(hemagglutinating virus of Japan)liposome-mediated retrograde gene transfer of human hepatocyte growth factor into rat nervous system promotes functional and histological recovery of the crushed nerve［J］．Neurosci Res，2005，52:299 －310．

［4］Koh SH，Baik W，Noh MY，et al．The functional deficiency of bone marrow mesenchymal stromal cells in ALS patients is proportional to disease progression rate［J］．Exp Neurol，2012，233:472 －480．

［5］Shi E，Jiang X，Wang L，et al．Intrathecal injection of hepatocyte growth factor gene-modified marrow stromal cells attenuates neurologic injury induced by transient spinal cord ischemia in rabbits［J］．Anesthesiology，2010，113:1109 －1117．

［6］Li Z，Peng J，Wang G，Yang Q，et al．Effects of local release of hepatocyte growth factor on peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts［J］．Exp Neurol，2008，214:47－54．

［7］代喻兵，駱文龍，陳紅江，等．面神經(jīng)損傷后rhEPO對(duì)面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］．中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2008，2:491－494．

［8］胡智興，耿菊敏，梁道明，等．肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子減輕皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧/復(fù)氧損傷［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30:369－373．

［9］劉鋮，闕海萍，靳繼德，等．肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子延長(zhǎng)原代培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元的生存時(shí)間［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26:957－961．