張傳海，葛自兵，白雪峰，孫 婉

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.安徽省舒豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，安徽 舒城231300；3.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安237012）

食用百合卷丹離體培養(yǎng)再生體系的建立

張傳海1，3，葛自兵2，白雪峰3，孫 婉3

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.安徽省舒豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，安徽 舒城231300；3.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安237012）

選取食用百合卷丹的鱗片作為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA和NAA的不同植物激素組合，分組進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和誘導(dǎo)生根培養(yǎng)。結(jié)果表明，鱗莖的中層鱗片具有較強(qiáng)的不定芽分化能力，6-BA 0.5mg／L＋ NAA 0.1 mg／L的激素組合適宜于鱗片的不定芽分化和繼代增殖，而最利于誘導(dǎo)生根的激素組合為NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.1mg／L。組培苗經(jīng)過(guò)60天左右培養(yǎng)可在培養(yǎng)基中直接產(chǎn)生小鱗莖。

百合卷丹；鱗片；不定芽；快速繁殖

百合為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生宿根草本植物，因其根莖由多數(shù)肉質(zhì)鱗片抱合和可治百病而得名。全世界共有90余種，原產(chǎn)我國(guó)的約有47種。百合是藥食同源的著名經(jīng)濟(jì)植物，其鱗莖肉質(zhì)鮮嫩，性味甘寒，富含營(yíng)養(yǎng)，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰潤(rùn)肺、抗衰老、治腫瘤、提高機(jī)體免疫力等多種功效［1-3］。

地處皖西大別山區(qū)的六安市霍山、舒城、金寨等縣，具有二十多年的食藥用百合人工栽培歷史，年種植規(guī)模達(dá)5萬(wàn)畝以上，霍山縣“漫水河百合”于2010年被國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，已發(fā)展成為區(qū)域性特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)［4］。

百合生產(chǎn)上，一般是通過(guò)分球、鱗片扦插等方式來(lái)進(jìn)行繁殖。對(duì)霍山等百合規(guī)模種植區(qū)的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于不規(guī)范的種球自繁、重茬栽培、病害預(yù)報(bào)與防治跟不上等原因，近年來(lái)主產(chǎn)區(qū)百合病害日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致種性退化，百合產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成了直接威脅［5］［6］。因此，建立百合脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)體系和種球繁育供應(yīng)基地，對(duì)于促進(jìn)當(dāng)?shù)匕俸袭a(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)在百合種苗快繁生產(chǎn)上有很大的應(yīng)用空間［7-9］。本文以皖西大別山區(qū)百合主栽品種卷丹的鱗片為材料，研究外植體來(lái)源、培養(yǎng)基中植物激素配比等因素對(duì)于不定芽誘導(dǎo)發(fā)生、繼代增殖以及生根成苗等組培過(guò)程的影響，并為進(jìn)一步開(kāi)展百合莖尖脫毒培養(yǎng)和建立規(guī)?；摱痉N苗生產(chǎn)技術(shù)體系提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試百合品種為卷丹（Lilium lancifolium Thunb）。從霍山縣漫水河鎮(zhèn)種植基地采挖健壯的百合鱗莖帶回，用沙埋藏備用。

1.1.2 儀器

電熱蒸汽滅菌器（YX-450，上海三申），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），電子天平（上海精科）。

1.1.3 試劑

乙醇，升汞，萘乙酸（NAA），6-芐氨基嘌呤（6-BA），MS培養(yǎng)基配方中的各種試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

基本培養(yǎng)基為：MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂粉50g／L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌闹参锛に亟M合；芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入0.05%活性炭，芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基皆不加活性炭。培養(yǎng)基的配制，按常規(guī)流程進(jìn)行，調(diào)整pH值至5.8，分裝后，高壓濕熱滅菌，冷凝備用。

1.2.2 外植體的消毒和接種

將百合鱗莖用自來(lái)水和軟毛刷洗凈，剝?nèi)プ钔鈱喻[片，選取潔白無(wú)病斑的鱗片作為外植體。在超凈工作臺(tái)上，將鱗片放入燒杯，加入75%乙醇浸泡10s，無(wú)菌水沖洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)入無(wú)菌燒杯中，加入0.1%升汞溶液浸泡10min，倒去升汞，無(wú)菌水沖洗4次。用滅菌濾紙吸去鱗片表面水分，在無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將鱗片切分為大約0.6cm×0.8cm的小塊，然后平放接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種4～6塊。轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度1200Lux，光照時(shí)間10～12h／d。

1.2.3 不同部位鱗片材料的芽誘導(dǎo)

剝離百合鱗片時(shí)，按自然生長(zhǎng)的外層、中層、內(nèi)層分為3類(lèi)，分別消毒、切塊和接種，培養(yǎng)30d，觀(guān)察記錄不定芽分化情況。

1.2.4 不同激素組合對(duì)不定芽分化的影響

將百合鱗片切塊分別接種在附加6-BA和NAA不同濃度組合的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀(guān)察統(tǒng)計(jì)不定芽分化率和單塊外植體的不定芽分化數(shù)量。

1.2.5 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)

當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽生長(zhǎng)到0.6cm左右時(shí)，將其從鱗片外植體上剝離，選取長(zhǎng)勢(shì)良好均一的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d，觀(guān)察不定芽的增殖情況。

1.2.6 不定芽的誘導(dǎo)生根

不定芽繼代增殖后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，至第30d，統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

平均產(chǎn)芽數(shù)＝不定芽總數(shù)／產(chǎn)芽的總外植體數(shù)；不定芽分化率（%）＝（產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)／接種的總外植體數(shù)）×100；芽增殖倍數(shù)＝增殖后不定芽數(shù)／接種的不定芽數(shù)；平均生根率（%）＝（生根的不定芽數(shù)／接種的不定芽數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位鱗片材料的不定芽誘導(dǎo)效果

鱗片切塊接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周，鱗片切口處發(fā)生膨大或凸起，不定芽逐步分化形成（圖1）。至第30d，統(tǒng)計(jì)外層、中層、內(nèi)層鱗片切塊的不定芽發(fā)生數(shù)量，結(jié)果（表1）表明，不同部位來(lái)源的鱗片外植體，其分化產(chǎn)生不定芽的能力有顯著差異，總體上呈現(xiàn)為中層＞外層＞內(nèi)層，鱗片的所處部位對(duì)不定芽分化有明顯影響。

表1 不同部位的鱗片材料誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的效果

2.2 不同植物激素對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的影響

在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度水平的6-BA和NAA激素組合，對(duì)中層鱗片切塊的不定芽誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。在設(shè)置的6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，以6-BA0.5mg／L＋NAA0.1mg／L的激素組合為優(yōu)，芽誘導(dǎo)率達(dá)到83.3%，平均每個(gè)外植體分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)為3.8個(gè)。就單一激素類(lèi)別對(duì)芽誘導(dǎo)分化的效應(yīng)而言，6-BA的使用濃度以0.5mg／L最佳，其次為1.0mg／L，0.1mg／L最差；而 NAA與6-BA的配比使用效果，0.1mg／L組皆?xún)?yōu)于0.5mg／L組。

表2 不同激素組合對(duì)中層鱗片誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的影響

2.3 植物激素對(duì)不定芽繼代增殖的影響

設(shè)定 NAA的濃度為0.1mg／L，改變6-BA的濃度，考查不定芽繼代培養(yǎng)的增殖效果，結(jié)果（表3）表明，當(dāng)6-BA的濃度為0.5mg／L時(shí)，增殖倍數(shù)最高，為3.60；繼續(xù)提高6-BA的濃度，芽增殖倍數(shù)呈現(xiàn)明顯下降。在6-BA為0.5mg／L的濃度水平上，以不添加NAA為對(duì)照，與添加NAA0.1mg／L的實(shí)驗(yàn)組相比，不定芽增殖數(shù)與增殖倍數(shù)有一定下降，但差異并不顯著。

表3 植物激素對(duì)不定芽繼代增殖的影響

2.4 不定芽的生根培養(yǎng)與小鱗莖發(fā)生

生根培養(yǎng)基的植物激素組合：6-BA固定為0.1mg／L，NAA 設(shè)置0.1、0.5、1.0、1.5mg／L共4個(gè)濃度；以不加任何植物激素為對(duì)照組。從繼代增殖的不定芽中，挑取長(zhǎng)勢(shì)一致者接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第10d左右開(kāi)始，不定芽的葉片抽展形成幼苗（圖2），芽體基部陸續(xù)誘導(dǎo)生根，從而形成完整試管苗。培養(yǎng)至第30d，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)生根情況，從表4結(jié)果可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組 NAA1.0mg／L＋6-BA0.1mg／L的誘導(dǎo)生根效果最好，根多，根系發(fā)達(dá)健壯。

表4 植物激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根的效果比較

觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，若完成上述誘導(dǎo)生根培養(yǎng)后不更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)40d左右，試管苗發(fā)生枯萎，但每株苗會(huì)相應(yīng)形成1～4個(gè)小鱗莖（圖3），可作種球使用或擴(kuò)大繁殖。

圖1 鱗片不定芽的發(fā)生

圖2 不定芽生長(zhǎng)成苗

圖3 試管苗產(chǎn)生小鱗莖

3 討論

百合鱗片常被選擇作為組培快繁的良好外植體。本研究以食用百合卷丹的鱗片為材料，探討不定芽分化發(fā)生、繼代增殖和誘導(dǎo)生根的基本影響因素，為進(jìn)一步建立以莖尖培養(yǎng)為基礎(chǔ)的百合脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)體系打下基礎(chǔ)。

影響百合鱗片誘導(dǎo)分化的因素是多方面的［10］［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一致的情況下，不同部位的鱗片，其不定芽分化率存在顯著差異，中層鱗片的芽分化能力最強(qiáng)，其次是外層鱗片，而內(nèi)層鱗片產(chǎn)生不定芽的數(shù)量最少。不同的外源激素組合對(duì)鱗片的不定芽分化也存在顯著影響，本實(shí)驗(yàn)選用6-BA與NAA兩種植物激素的不同濃度水平配比，考查對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果，以0.5mg／L6-BA與0.1mg／LNAA的組合最佳，不定芽誘導(dǎo)分化率達(dá)到83.3%，在此基礎(chǔ)上提高6-BA的濃度水平反而會(huì)降低芽分化率。本實(shí)驗(yàn)在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加了0.05%的活性炭，而我們做過(guò)與不加活性炭實(shí)驗(yàn)組的比較研究（結(jié)果未報(bào)道），發(fā)現(xiàn)MS基本培養(yǎng)基添加一定量的活性炭，不僅可以提高不定芽的誘導(dǎo)效率，而且產(chǎn)生的芽較為壯實(shí)，有利于后期增殖和生長(zhǎng)。

通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)卷丹鱗片不定芽誘導(dǎo)的適宜激素組合也最適于芽的增殖培養(yǎng)，芽增殖的6-BA濃度以0.5mg／L最佳，而外源 NAA 保持在0.1mg／L的低濃度水平為宜。對(duì)于不定芽的誘導(dǎo)生根而言，NAA1.0mg／L＋6-BA0.1mg／L的激素組合誘導(dǎo)效果最好，產(chǎn)生的不定根多，根系發(fā)達(dá)健壯。

關(guān)于百合的組織培養(yǎng)已有大量研究報(bào)道［12］。不同品種、不同地域的實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于研究結(jié)果可能具有直接影響，得到的結(jié)論會(huì)呈現(xiàn)差異化，因此，實(shí)際研究或生產(chǎn)中，應(yīng)充分考慮到基因型、內(nèi)源性激素等因素的影響，建立科學(xué)客觀(guān)的技術(shù)體系。

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Establishment of Regeneration Systems by Squama Culture of Lilium LancifoliumThunb

ZHANG Chuan-hai1，3，GE Zi-bing2，BAI Xue-feng3，SUN Wan3
（1.College of Biological and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu’an237012，China；2.Anhui Shufeng Modern Agriculture Science and Technology Development Limited Company，
Shucheng231300，China；3.Plant Biotechnology Training Center of Anhui Province，Lu’an237012，China）

Squamas of edible lily bulbs of Lilium lancifoliumThunb were used as explants，and MS media added different combination of 6-BA and NAA were employed for adventitious bud induction，bud multiplication subculture and root induction.The results showed that bud differentiation ability of outward squamas was better than that of inward ones，the medium MS＋6-BA 0.5mg／L＋ NAA 0.1mg／L was optimal both to bud induction and to bud multiplication，and the optimal medium for rooting was MS＋ NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.1mg／L.Small bulbs directly generated from seedlings after an about 60days’continuous culture in the medium.

Lilium lancifolium；Thunb；bulb squamas；adventitious buds；rapid propagation

Q813.1

A

1009-9735（2012）02-0001-03

2012-02-12

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2012A278）。

張傳海（1965-），男，安徽金寨人，教授，博士，研究方向：植物生物技術(shù)。