石海利，蔣舜媛，徐凱節(jié)，張艷俠，周 毅，宋美鳳，彭樹(shù)林*

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)與創(chuàng)新中藥四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041

羌活藥材活性成分的提取工藝研究

石海利1，蔣舜媛2，徐凱節(jié)1，張艷俠1，周 毅2，宋美鳳2，彭樹(shù)林1*

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)與創(chuàng)新中藥四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041

選擇提取次數(shù)、溶劑倍數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，以提取浸膏量及三種主要活性物質(zhì)(紫花前胡苷、異歐前胡素、羌活醇)含量為考察指標(biāo)，探討羌活藥材活性成分的乙醇加熱回流提取工藝。在首先考察單因素對(duì)提取效果影響的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選出羌活藥材活性成分的最佳提取工藝參數(shù):加6倍量95% 乙醇，加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為1 h。

羌活;提取工藝;正交試驗(yàn);活性成分

羌活(Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang)為我國(guó)特有的傘形科草本植物，其根莖及根為羌活藥材的主要來(lái)源，具有解表散寒、祛風(fēng)除濕、止痛的功效，主要用于治療風(fēng)寒感冒、頭痛項(xiàng)強(qiáng)、風(fēng)濕痹痛、肩背酸痛等癥［1］。近代藥理學(xué)研究表明，羌活藥材具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)及增強(qiáng)肌體免疫功能的作用，其主要活性成分是以羌活醇、紫花前胡苷、異歐前胡素為代表的香豆素類(lèi)化合物［2-4］。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于羌活提取工藝已有報(bào)道［3，5，6］，但其在研究中僅以紫花前胡苷為考察指標(biāo)，不能完全反映提取物的質(zhì)量。所以我們考慮在此基礎(chǔ)上對(duì)羌活藥材的提取工藝進(jìn)行改進(jìn)?？紤]到規(guī)?；a(chǎn)中成本、效率、安全及產(chǎn)品質(zhì)量等方面問(wèn)題，本文采用加熱回流的提取方法，選用乙醇為溶劑，以揮發(fā)油含量、羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷為檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選工藝參數(shù)，從而為羌活提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供安全、環(huán)保、高效的工藝參數(shù)和方案，為羌活藥材資源的高效利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)樣品為從四川省小金縣兩河鄉(xiāng)大板村收購(gòu)的2010年秋季產(chǎn)野生曬干樣品，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院蔣舜媛老師鑒定為羌活(N.incisum)。

METTLER AE 240電子天平;HHS電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠(chǎng));BUCHI R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó));WP-15型循環(huán)水式真空泵(日本);Finnigan LCQDECA型液質(zhì)聯(lián)用儀;所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件及方法學(xué)考察

1.2.1.1 儀器條件

高效液相色譜儀部分為T(mén)SP公司Spectra system液相色譜儀(包括 SCM1000真空脫氣機(jī)、ASM3000自動(dòng)進(jìn)樣器、P4000四元梯度泵、UV6000LP二極管陣列紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器)。色譜柱:TIANHE kromasil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相條件:甲醇和0.1%乙酸水溶液梯度洗脫(甲醇比例由35%到87.5%緩慢梯度變化)。柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;流速:0.7 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取3個(gè)對(duì)照品各5 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液混合并用甲醇定容至5 mL容量瓶中，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍

精密依次吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液8個(gè)不同質(zhì)量濃度進(jìn)行HPLC分析，在上述色譜條件下檢測(cè)峰面積，同一質(zhì)量濃度連續(xù)測(cè)定3次，3種成分均以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，平均峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，相關(guān)系數(shù)與線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1，對(duì)照品儲(chǔ)備液繼續(xù)稀釋?zhuān)謩e在信噪比為3和10時(shí)得到檢測(cè)限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)，相應(yīng)的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品1～3的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、LOD和LOQTable 1 Regression equation，correlation coefficients，linearity ranges，LOD and LOQ for the three markers of N.incisum

1.2.1.4 精密度試驗(yàn)

日內(nèi)精密度試驗(yàn):在上述色譜條件下，將混標(biāo)溶液在一天內(nèi)共測(cè)定6次，計(jì)算得各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積的 RSD分別在0.31% ～0.66%和1.01%～1.82%范圍內(nèi)。

日間精密度試驗(yàn):在上述色譜條件下，將混標(biāo)溶液連續(xù)三天，每天進(jìn)樣兩次，計(jì)算得各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別在0.32% ～0.75%和1.58%～2.22%范圍內(nèi)。

1.2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取羌活粗粉5份，各0.5 g，分別加入一定量的對(duì)照品1～3，按上述提取方法和色譜條件平行提取和分析測(cè)定，被分析的對(duì)照品的總量由回歸曲線(xiàn)求得，對(duì)照品1～3的平均加樣回收率分別為93.7%、95.5% 和96.7%，RSD分別為3.39%、2.94%和2.65%。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

1.2.2.1 溶劑濃度的考察及結(jié)果

定量稱(chēng)取樣品3份，每份80 g，分別用65%、80%和95%乙醇320 mL(料液比為1∶4)加熱回流提取一次，時(shí)間為1.5 h，過(guò)濾，蒸干，稱(chēng)重，得浸膏。定量取出一部分浸膏用甲醇定容至25 mL容量瓶，取2 mL樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。HPLC定量測(cè)定異歐前胡素、羌活醇和紫花前胡苷的含量，水蒸氣蒸餾法測(cè)定總浸膏中揮發(fā)油的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1和2。

1.2.2.2 提取次數(shù)的考察及結(jié)果

定量稱(chēng)取樣品4份，每份20 g，用80 mL 95%乙醇分別提取1次、2次、3次和4次，每次時(shí)間為120 min，過(guò)濾，蒸干，稱(chēng)重，得浸膏。定量取出一部分浸膏用甲醇定容至25 mL容量瓶，取2 mL樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。HPLC定量測(cè)定異歐前胡素、羌活醇和紫花前胡苷的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 三種主要成分的含量隨提取次數(shù)變化曲線(xiàn)圖Fig.3 Effects of times of extraction on the three main components

1.2.2.3 提取時(shí)間的考察及結(jié)果

定量稱(chēng)取樣品5份，每份20 g，用95% 乙醇80 mL分別提取60、90、120、150和180 min，過(guò)濾，蒸干，稱(chēng)重，得浸膏。并定量取出一部分浸膏用甲醇定容至25 mL容量瓶，取2 mL樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。HPLC定量檢測(cè)異歐前胡素、羌活醇和紫花前胡苷的含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取次數(shù)(A)、溶劑倍數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)三個(gè)因素，每因素根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果各選三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以所得浸膏重量及浸膏中的羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷三種主要成分含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2。

圖4 三種主要成分的含量隨提取時(shí)間變化曲線(xiàn)圖Fig.4 Effects of extraction duration on the three main components

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)中羌活的提取和測(cè)定指標(biāo)方法

精密稱(chēng)取干燥的羌活粗粉20 g，加入95% 乙醇，加熱回流提取，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至干，稱(chēng)量所得干浸膏重量并用HPLC法對(duì)羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷的含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算三種物質(zhì)的總量。

綜合評(píng)分(F):根據(jù)實(shí)際情況將干浸膏重量(X)、三種物質(zhì)總量(Y)的權(quán)重系數(shù)分別定為0.8、0.2。分別以X項(xiàng)、Y項(xiàng)中各自的最大值為80、20分作為比較，計(jì)算公式如下:綜合評(píng)分(F)=(X/ Xmax)×80+(Y/Ymax)×20

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表頭和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 羌活提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

3 1 3 3 3 5.7636 0.2303 82.61 4 2 1 2 3 5.3868 0.2761 81.23 5 2 2 3 1 6.0981 0.2972 90.95 6 2 3 1 2 6.3678 0.3026 94.46 7 3 1 3 2 5.7895 0.1952 80.60 8 3 2 1 3 6.8419 0.2735 98.08 9 3 3 2 1 6.7615 0.1739 90.55 K1/3 75.837 76.263 86.500 82.820 K2/3 88.880 88.990 83.240 84.333 K3/3 89.743 89.207 84.720 87.307 R 13.906 12.944 3.260 4.487

表4 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 4 Analysis of variance

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的程度依次為:A＞B＞C。即影響最大的是提取次數(shù)，A3為最優(yōu)水平;其次為溶劑倍數(shù)，B3為最優(yōu)水平，均對(duì)結(jié)果有較顯著性影響(P＜0.1);提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不顯著(P＞0.1)。由以上數(shù)據(jù)得出最佳提取條件為:A3B3C1。即提取4次，乙醇用量8倍量，提取時(shí)間為1 h。本項(xiàng)研究的目的是使其能工業(yè)化生產(chǎn)，從工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的效率、能耗、成本等綜合考慮，A3與A2、B3與B2間的差異甚微，因此選擇最佳的提取方案為A2B2C1。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取干燥的羌活粗粉20 g，加入95%乙醇，按最佳提取方案A2B2C1進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得干浸膏6.8550 g;羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷三種物質(zhì)總量為0.3097 g。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的效率、能耗、成本等因素，得出羌活提取物的最佳提取方案為A2B2C1。即:用6倍量95% 乙醇，加熱回流提取3次，每次1 h。

3.2 討論

3.2.1 羌活醇為羌活屬植物的特征化合物，異歐前胡素和紫花前胡苷也是羌活中的主要成分，其中紫花前胡苷為常用鑒定指標(biāo)。羌活醇和異歐前胡素以及揮發(fā)油含量在各類(lèi)研究報(bào)道及我國(guó)藥典中常被作為羌活藥材品質(zhì)檢測(cè)的指標(biāo)成分［1，6］，因此以這三種物質(zhì)的含量和所得浸膏量作為提取效果衡量的指標(biāo)，可較為客觀地評(píng)價(jià)羌活乙醇提取物的質(zhì)量。

3.2.2 本項(xiàng)研究考慮了浸膏中揮發(fā)油的含量，且羌活醇和異歐前胡素均為脂溶性成分，結(jié)合單因素研究結(jié)果，在正交試驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)溶劑濃度進(jìn)行考察，只用95%乙醇作提取溶劑。

1 Pharmacopoeia Commission of People’s Republic of China (中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of People’s Republic of China，Part I(中華人民共和國(guó)藥典，一部).Beijing:Chemistry Industry Press，2010.170-171.

2 Li YX(李云霞)，Gao CH(高春華).Progress in researches on the chemical constituents and pharmacological activities ofNotopterygium incisum.J Liaoning Coll Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2004，6:22-23.

3 Wu YQ(吳亦琴)，Chen MM(陳明明)，Zhao ZH(趙宗惠)，et al.Progress in researches onNotopterygium incisum.Chin J Lab Med Educ(檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育)，2005，12:33-35.

4 Zheng HZ(鄭虎占)，Dong ZH(董澤宏)，She J(佘靖).Modern Study of Traditional Chinese Medicine(中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用).Beijing:Academy Press，1998.3005-3013.

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Study on Extraction Technology of Bioactive Components from Notopterygium incisum

SHI Hai-li1，JIANG Shun-yuan2，XU Kai-jie1，ZHANG Yan-xia1，ZHOU Yi2，SONG Mei-feng2，PENG Shu-lin1*

1Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China;2Sichuan Key Laboratory of Quality and Innovation Research of Chinese Materia Medica，Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China

To optimize the extracting procedure forNotopterygium incisum，orthogonal design was carried out.Taking the amount of solvent，times of extraction and extraction duration as the test factors and the amount of extract，nodakenin，isoimperatorin and notopterol as the test indexs，the L9(34)orthogonal design was used to optimize the extraction technology ofN.incisum.The results showed that the best extraction technology was as follows:refluxing extraction with 6 times of 95%alcohol for 3 times(1 h each time).

Notopterygium incisum;extracting procedure;orthogonal array design;bioactive component

R284.2;Q946.91

A

1001-6880(2012)05-0687-05

2011-07-01 接受日期:2011-11-23

科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題(2009ZX09308-002，2009ZX09103-439);四川省科技攻關(guān)項(xiàng)目(07SG003-006)

*通訊作者 Tel:86-28-85223843;E-mail:pengsl@cib.ac.cn