麻 攀，于煒婷，魏 鵬，許青松，白雪芳，杜昱光*

1中國科學院大連化學物理研究所1805組，大連 116023;2中國科學院研究生院，北京 100049

殼寡糖作用于巨噬細胞的機制初探

麻 攀1，2，于煒婷1，2，魏 鵬1，2，許青松1，白雪芳1，杜昱光1*

1中國科學院大連化學物理研究所1805組，大連 116023;2中國科學院研究生院，北京 100049

研究殼寡糖對免疫系統(tǒng)中巨噬細胞作用的具體機制。結合流式細胞儀和激光共聚焦實驗檢測殼寡糖與巨噬細胞相互作用，通過凝膠阻滯實驗在體外驗證殼寡糖的胞內(nèi)定位。實驗結果證明殼寡糖與巨噬細胞相互作用過程如下，先與細胞膜結合，然后進入細胞內(nèi)，最后定位在細胞核的核酸(DNA/RNA)上。

殼寡糖;巨噬細胞;DNA;RNA

巨噬細胞是機體內(nèi)具有強大吞噬功能的細胞，廣泛分布于全身各處組織內(nèi)。它不僅擔負著機體的非特異性防御功能，不斷清除外源異物、體內(nèi)衰老以及變異細胞，并且還可以作為抗原呈遞細胞將特異性免疫應答和非特異性免疫應答相連從而輔助機體免疫。幾丁質(zhì)的脫乙酰降解產(chǎn)物殼寡糖因其不但具有幾丁質(zhì)、殼聚糖的許多生理活性之外，如抗菌［1］，抗氧化［2］，抗腫瘤［3，4］和免疫調(diào)節(jié)［5］等，還具有分子量小、毒性低、水溶性好等幾丁質(zhì)和殼聚糖所不具備的優(yōu)點，因此已經(jīng)越來越受到人們的青睞。本實驗通過相應方法驗證了殼寡糖與巨噬細胞的相互作用機制以及殼寡糖在巨噬細胞胞內(nèi)定位，這將為今后相關的研究提供了較好的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品試劑、儀器

殼寡糖:本實驗室生產(chǎn)(聚合度2-8，脫乙酰度大于95%)，RAW264.7巨噬細胞株(上海細胞庫)，RPMI1640細胞培養(yǎng)液(sigma)，胎牛血清(杭州四季青)，2-AMAC(sigma)，CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus公司)，離心機(德國 Heraeus公司)，激光共聚焦(Leica SP2型)，流式細胞儀(BD FACSVantage SE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)，在條件為5%CO2濃度，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，三天傳一代。

1.2.2 流式細胞儀檢測殼寡糖與巨噬細胞的結合

選取處于對數(shù)生長期的細胞(1×105個/mL)，用0.1 M PBS洗三遍，離心(1000 rpm，5 min)回收細胞。殼寡糖用熒光標記物2-AMAC標記［6］，以下簡稱之為2-AMAC-COS。將回收的細胞分別與2-AMAC或2-AMAC-COS在4℃下孵育15 min。殼寡糖競爭組則將細胞與2-AMAC-COS在4℃下孵育15 min后，再與未標記殼寡糖4℃下孵育15 min，用4%多聚甲醛固定液固定，進行流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm。全過程在避光條件下進行。

1.2.3 激光共聚焦檢測殼寡糖與巨噬細胞相互作用

將處于對數(shù)生長期的巨噬細胞(1×105個/ mL)等量地接種到蓋玻片上，讓其貼壁24 h形成細胞單層。取出帶有細胞單層的蓋玻片用0.1 M PBS洗三遍后，分別與2-AMAC或2-AMAC-COS在37℃下孵育指定的時間。PBS洗三遍，用4%多聚甲醛固定液固定后，進行激光共聚焦檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm。全過程在避光條件下進行。

1.2.4 DNA/RNA結合實驗

用CTAB法提取細胞總基因組DNA，Trizol試劑盒(寶生物，大連)提取細胞總RNA。分別用300 ng基因組DNA或1 μg總RNA與殼寡糖以相應比例在室溫下孵育30 min后，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。DNA組用0.5%瓊脂糖凝膠檢測，RNA組用1%瓊脂糖凝膠檢測。RNA組全過程用具均用DEPC水處理以去除RNA酶降解影響。DNA組中已用RNA酶處理去除RNA干擾。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)結果均重復三遍以上以確保準確性。

2 結果和討論

2.1 殼寡糖與巨噬細胞的結合

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)殼寡糖與巨噬細胞有較明顯地結合作用。圖1.A顯示，用熒光標記物2-AMAC標記殼寡糖后，讓其與巨噬細胞在4℃下結合15 min，熒光峰明顯右移，熒光值顯著增強，表明熒光標記殼寡糖明顯地結合到巨噬細胞上。當用未標記的殼寡糖競爭這種結合作用后，發(fā)現(xiàn)可以顯著競爭掉熒光標記殼寡糖與巨噬細胞的結合(圖1.B)，表明殼寡糖與巨噬細胞的這種結合作用是可逆的。

2.2 殼寡糖與巨噬細胞的相互作用

發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以與巨噬細胞可逆地結合后，我們更希望直觀地看到殼寡糖與巨噬細胞的相互作用的過程，因此我們用激光共聚焦實驗來進行下一步驗證。如圖2所示，隨著時間的遞進，殼寡糖與巨噬細胞的相互作用是一種有序的過程。首先，殼寡糖結合到細胞的表面，隨著時間延長，殼寡糖進入到細胞質(zhì)中，最后定位到細胞核內(nèi)(如圖中箭頭所示)。而熒光標記物2-AMAC只是彌散在細胞內(nèi)，并且其熒光強度要明顯低于2-AMAC-COS。因為其分子量較小，它可能是通過被動擴散的方式進入細胞內(nèi)的，而2-AMAC-COS則可能是一種受體介導的方式。殼寡糖進入細胞的方式我們會在接下來的實驗中繼續(xù)驗證。

2.3 殼寡糖與核酸(DNA/RNA)的體外結合作用

在圖2中我們發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以明顯地定位在核內(nèi)，因此，我們想證明殼寡糖是定位在核內(nèi)的哪些部位。我們用凝膠阻滯實驗(gel-retardation assay)在體外驗證了殼寡糖與DNA/RNA的結合作用。圖3指出殼寡糖能明顯地阻止核酸在膠內(nèi)的遷移，并且這種阻止作用隨著殼寡糖與核酸比例的增加而逐漸增強，殼寡糖與DNA的結合效果要好于RNA。表明殼寡糖在細胞核內(nèi)是定位在核酸上。當然，也不排除其有可能也會定位在某些核內(nèi)蛋白上，在接下來的實驗中，我們也會做相應的驗證。

圖3 殼寡糖與DNA/RNA體處結合作用Fig.3 The binding between COS and DNA/RNAin vitro

3 結論

本實驗驗證了殼寡糖與巨噬細胞相互作用的機制以及其在巨噬細胞內(nèi)的定位情況。它是以一種有序的方式作用于細胞，首先與細胞膜可逆地結合，然后進入到細胞質(zhì)中，最后定位在核內(nèi)的核酸(DNA/RNA)上。

1 Qin CQ，Li HR，Xiao Q，et al.Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity.Carbohydr Polym，2006，63: 367-374.

2 Huang RH，Rajapakse N，Kim SK.Structural factors affecting radical scavenging activity of chitooligosaccharides(COS) and its derivatives.Carbohydr Polym，2006，63:122-129.

3 Xu QS，Dou JL，Wei P，et al.Chitooligosaccharides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via upregulation of Bax.Carbohydr Polym，2008，4:509-514.

4 Xu QS，Wei P，Dou JL，et al.Studies on the Inhibitory effects of oligochitosan on SMMC-7721 cells of hepatocarcinoma.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:152-154.

5 Dou JL，Tan CY，Du YG，et al.Effects of chitooligosaccharides on rabbit neutrophils in vitro.Carbohydr Polym，2007，69:209-213.

6 Zhao XM，She XP，Yu W，et al.Effects of oligochitosans on tobacco cells and role of endogenous nitric oxide burst in the resistance of tobacco to Tobacco mosaic virus.J Plant Pathol，2007，89:55-65.

Mechanisms of Chitosan Oligosaccharides Acting on Macrophage

MA Pan1，2，YU Wei-ting1，2，WEI Peng1，2，XU Qing-song1，BAI Xue-fang1，DU Yu-guang1*

1Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China;2Graduate School of Chinese Academy Sciences，Bejing 100049，China

The molecular mechanisms of chitosan oligosacchrides(COS)acting on macrophages in immune system were investigated here.Through Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)and Flow cytometric analysis，we examined the interaction between COS and macrophages.Gel-retardation experiment was used to investigate the location of COS in the nucleus.The results suggested that the interaction between COS and macrophages was followed in proper sequence.First，COS bound to the plasma membrane of macrophage cells before entering into the cytoplasm，and lastly，it was located on DNA/RNA in the nucleus.

chitosan oligosaccharides(COS);macrophage;DNA;RNA

R392.12

A

1001-6880(2012)05-0660-03

2010-11-26 接受日期:2011-04-08

國家科技重大專項課題(2009ZX095010)新藥研究開發(fā)關鍵技術研究

*通訊作者 Tel:86-411-84379060;E-mail:articles1805@gmail.com