李麗梅，高丙利，柳 東，李興林

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

抗黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌篩選及其抑菌活性的初步研究

李麗梅1,2，高丙利2，柳 東1,2，李興林1

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

結(jié)合涂布平板法和溫室盆栽植株法，測(cè)定了41株枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)灰霉病病原菌及黃瓜灰霉病的抑制效果，以此篩選出針對(duì)灰霉病的生防菌株．結(jié)果表明，抑菌效果最好的枯草芽孢桿菌為BS01和BS03．采用涂布平板法研究了菌株BS01和BS03抑菌活性，結(jié)果表明，抑菌效果均為50%時(shí)，BS03比BS01的菌體濃度低，得到抑菌效果最好的菌株BS03．采用溫室盆栽植株法測(cè)試了菌株BS03的抑菌活性，結(jié)果表明，菌懸液比發(fā)酵濾液的抑菌效果好，并且在菌懸液處理黃瓜苗后的第3天抑菌活性最高．

灰霉??；生物防治；枯草芽孢桿菌

植物真菌病害每年給糧食和蔬菜的生產(chǎn)造成巨大的損失．目前，普遍采用化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害．化學(xué)農(nóng)藥毒害非靶標(biāo)生物、污染環(huán)境并使有害生物產(chǎn)生抗藥性．而生物農(nóng)藥具有選擇性高、易于降解、不易積累、用量少、污染小、對(duì)人畜毒性小、環(huán)境兼容性好、病蟲害不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[1]．因此，使用生物農(nóng)藥是克服化學(xué)防治造成環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡的有效途徑之一[2]．

枯草芽孢桿菌是目前生物農(nóng)藥中研究相對(duì)較多的一種細(xì)菌類微生物．該類菌在自然界中廣泛存在，是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)人畜無明顯毒害，具有顯著的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存，是一種理想的生防細(xì)菌．近年來，國內(nèi)外學(xué)者在枯草芽孢桿菌防治植物病害方面進(jìn)行了大量研究，并已開發(fā)出多種商品化菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3]．

然而枯草芽孢桿菌的主要防治對(duì)象是水稻紋枯病、小麥紋枯病、番茄葉霉病、豆類根腐病、蘋果霉心病、棉花立枯病、棉花枯萎病等．用于防治灰霉病的枯草芽孢桿菌還很少，且主要集中在番茄和草莓上的灰霉病防治上，因此用于防治黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌的研究就更少．本研究的目的是篩選出能夠抑制黃瓜上灰霉病菌的枯草芽孢桿菌菌株，為開發(fā)防治黃瓜灰霉病的微生物殺菌劑奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 寄主植物

黃瓜為津優(yōu)黃瓜一號(hào)，由湖州市種子市場上購買．

1.1.2 菌株

41株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)，由浙江東奇生物科技有限公司提供．病原指示菌為黃瓜灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)，由浙江化工院有限公司生物測(cè)試中心提供．

1.1.3 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂15，pH 7.0

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.0

PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆 200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH．

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液制備

從斜面取1環(huán)挑取枯草芽孢桿菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在回轉(zhuǎn)式搖床30,℃、220,r/min條件下培養(yǎng)1,d，制得種子液，并以2%接種量轉(zhuǎn)接到裝有90,mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，在30,℃、220,r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液(含有菌體)備用．

1.2.2 發(fā)酵濾液的制備

將發(fā)酵液4,000,r/min 離心30,min，上清液經(jīng)過0.22,μL膜過濾，濾除菌體，獲得無菌發(fā)酵上清液．

1.2.3 菌懸液的制備

將發(fā)酵液4,000,r/min 離心30,min，棄上清液，加入新鮮的NA培養(yǎng)基直至與原發(fā)酵液相同的體積．

1.2.4 灰霉菌菌塊的制備

在無菌條件下，取20,mL經(jīng)滅菌后冷卻至45,℃左右的PDA培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿，制成PDA平板．放置24,h后，在平板中央接種灰霉菌菌絲，22,℃培養(yǎng)4,d．在已長好的灰霉菌平皿中，用直徑0.5,cm打孔器在菌落邊緣切取菌落圓塊，備用．

1.2.5 枯草芽孢桿菌對(duì)灰霉菌的抑制作用

用無菌水稀釋發(fā)酵液至菌體濃度為1×105,mL–1的稀釋液，其中枯草芽孢桿菌計(jì)數(shù)法采用的是顯微直接計(jì)數(shù)法．向放置1,d的PDA平板中加入100,μL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵稀釋液，用涂布器涂勻，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)．將切取的灰霉菌菌塊接種在涂好的平板中央，有菌絲的一面接觸平板．25,℃培養(yǎng)4,d后，用直尺“十字交叉法”測(cè)量灰霉菌菌落直徑(單位為cm)，結(jié)果取其平均值．

1.2.6 枯草芽孢桿菌對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果

選擇1片真葉期長勢(shì)一致的盆栽黃瓜苗，藥劑噴霧處理(以葉片滴下液滴為準(zhǔn))后自然晾干24,h，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)．用鑷子將菌塊接種在葉片中央，有菌絲的一面接貼于葉面．然后將黃瓜苗放在不同的濕盒中，25,℃下黑暗保濕24,h，再維持相對(duì)濕度90%左右、光暗周期(d/n)10,h/14,h下培養(yǎng)3,d．用直尺“十字交叉法”測(cè)病斑直徑(單位為cm)，結(jié)果取其平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株枯草芽孢桿菌對(duì)灰霉菌的抑制效果比較

測(cè)試41株枯草芽孢桿菌發(fā)酵液(菌體濃度1× 105,mL–1)對(duì)灰霉菌的抑制作用．供試枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)灰霉菌菌絲生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用．其中BS01、BS03、095802、095303、094510和142203菌株對(duì)灰霉菌菌絲生長的抑制作用達(dá)到了50%以上．BS01和BS03對(duì)灰霉菌菌絲生長的抑制效果與稀釋100倍的50%撲海因懸浮劑相當(dāng)，抑菌率分別為64%和61%．

為了進(jìn)一步確定初篩結(jié)果的可靠性，利用平板法對(duì)BS01、BS03、095802、095303、094510和142203菌株的發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩．共設(shè)3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)重復(fù)，取3個(gè)重復(fù)抑菌率的平均值作為1次實(shí)驗(yàn)的分析值，結(jié)果見表1．

將自磨刃強(qiáng)化處理的刀片對(duì)稱安裝在鍘草機(jī)上,在3個(gè)月的秸稈(約40t)加工過程中，刀片沒有經(jīng)過人為磨刀。刀片始終保持良好的銳利度(如圖7所示)，出現(xiàn)了不同程度的自磨刃效果。3種刀片不同程度上出現(xiàn)了崩刃現(xiàn)象，在崩刃的地方也出現(xiàn)自磨刃效果。不同滲層的刀片質(zhì)量變化也有所不同，具體磨損質(zhì)量如表5所示。磨損質(zhì)量對(duì)比分析：

由表1可知，在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，供試菌株的發(fā)酵液對(duì)灰霉菌菌絲生長均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，而且標(biāo)準(zhǔn)差在10%以內(nèi)，重復(fù)性較好；在3次實(shí)驗(yàn)中，各枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液對(duì)灰霉菌菌絲生長的抑菌率趨勢(shì)基本一致，其中，BS01和BS03對(duì)灰霉菌菌絲生長的抑菌率為最高，分別為67.91%和65.45%．

表1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)灰霉菌的抑制作用Tab. 1 Inhibition of Bacillus on Botrytis cinerea growing

2.2 復(fù)篩后的6株枯草芽孢桿菌對(duì)盆栽黃瓜灰霉病的防治效果

為了驗(yàn)證平板法篩選出的菌株發(fā)酵液在植物活體上對(duì)病原菌的抑制效果，以盆栽黃瓜苗為寄主植物，檢測(cè)BS01、BS03、095802、095303、094510和142203發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果，結(jié)果見表2.

表2 枯草芽孢桿菌對(duì)黃瓜灰霉病菌的防治效果Tab. 2 Efficacies of Bacillus against gray mold on cucumber leaves

從表2中可以看出，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)溫室盆栽黃瓜灰霉病的抑制作用低于平皿實(shí)驗(yàn)中對(duì)灰霉病菌的抑制效果．095802、095303和142203發(fā)酵液在植物活體實(shí)驗(yàn)中對(duì)灰霉病沒有防治作用，094510有29.73%的抑制效果；BS01和BS03仍然保持對(duì)黃瓜灰霉病一定的抑制作用，抑菌率分別為47.62%和53.44%．

2.3 菌株BS01和BS03對(duì)灰霉菌菌絲的抑制作用

分別稀釋BS01和BS03的發(fā)酵液至菌體濃度為108、107、106、105、104、103、102,mL–1，采用涂布平板法測(cè)試不同的菌體濃度的發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉菌菌絲的抑制作用．

由圖1可知隨發(fā)酵液中菌體濃度的降低，發(fā)酵液對(duì)灰霉菌菌絲生長的抑制作用減弱，其中BS01發(fā)酵液對(duì)灰霉菌抑制作用的下降趨勢(shì)比BS03明顯．另外，當(dāng)菌體濃度為103,mL–1時(shí)，菌株BS03和BS01抑菌率仍在50%左右．

圖1 菌株BS01和BS03對(duì)黃瓜灰霉菌菌絲的抑制作用Fig. 1 Efficacies of BS01 and BS03 on Botrytis cinerea growing

表3 菌株BS01和BS03對(duì)灰霉菌菌絲生長的影響(自由度f＝6)Tab. 3 Effects of BS01 and BS03 on Botrytis cinerea growth

由表3可知，當(dāng)抑菌率為50%時(shí)，BS03的菌體濃度低于BS01的菌體濃度，因此BS03抑菌效果比BS01的抑菌效果好．

2.4 菌株BS03發(fā)酵濾液、菌懸液的抑菌活性

發(fā)酵濾液易于加工劑型，新鮮的培養(yǎng)基在加工劑型中具有保護(hù)菌體的作用；因此，研究發(fā)酵濾液和菌懸液的抑菌活性具有一定的意義．

將發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、菌懸液稀釋1、2、5、10、20倍，以發(fā)酵液作對(duì)照，比較菌懸液和發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病的防治效果，結(jié)果如圖2所示．菌懸液、發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病的防治效果隨其濃度的降低而降低，說明發(fā)酵濾液和菌懸液在防治灰霉病中起到一定作用．其中，當(dāng)發(fā)酵濾液稀釋10倍和稀釋20倍時(shí)，發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病幾乎沒有防治作用；稀釋20倍時(shí)的防治效果反而比稀釋10倍時(shí)的防治效果更好，這可能是由于誤差作用．菌懸液對(duì)灰霉病的防治效果高于發(fā)酵濾液，說明選擇菌懸液防治黃瓜灰霉病優(yōu)于發(fā)酵濾液.

圖2 發(fā)酵液、菌懸液、發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜灰霉病菌的防治效果Fig. 2 Efficacies of fermentation liquid，bacterial suspendsion，supernatant against gray mold on cucumber

2.5 病原菌的接種時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

在測(cè)試發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、菌懸液防治效果實(shí)驗(yàn)中，菌懸液表現(xiàn)出較高的防治效果，僅次于發(fā)酵液．考察菌懸液處理黃瓜苗后，在不同時(shí)間接種灰葡萄孢菌，其對(duì)灰霉病的防治效果如圖3所示．

圖3 病原菌接種時(shí)間對(duì)防治效果的影響Fig. 3 Control efficacy of different intervals after treatment

由圖3可知，用菌懸液處理3,d后接種病原菌，對(duì)灰霉病的防治作用最高，表現(xiàn)良好的防病效果，其防效達(dá)63.92%．可能是由于菌體的定殖能力和菌體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的快速利用抑制了葡萄孢菌的生長，從而達(dá)到防治灰霉病的作用．

3 討 論

芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢(shì)生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用．許多優(yōu)良的天然菌株已成功地用于防治植物病害．Bacon等[4]分離的玉米內(nèi)生枯草芽孢桿菌與病原串珠鐮孢菌有相同的生態(tài)位，枯草芽孢桿菌能在玉米體內(nèi)迅速定殖和繁殖，有效降低串珠鐮孢菌及毒素的積累．Papavizas等[5]報(bào)道，枯草芽孢桿菌可以防治水稻等作物的多種土傳真菌?。瓾wang等[6]報(bào)道，枯草芽孢桿菌可以防治豌豆的根腐?。?0世紀(jì)90年代后，國外許多枯草芽孢桿菌制劑上市．日本東京技術(shù)研究所的枯草芽孢桿菌RB14和NB22分別對(duì)Rhizoctonia solani、Fusarium orysporum和Pseudornonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效[7]．至2001年，美國已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株，QST713、GBO3、MBI600和FZB24均獲得了美國環(huán)保署(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[8]．我國一些科研人員也對(duì)具有生防作用的枯草芽孢桿菌進(jìn)行了研究．王雅平等[9]采用室內(nèi)平皿實(shí)驗(yàn)、盆栽和田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)確定枯草芽孢桿菌A014菌株對(duì)小麥赤霉病的防效達(dá)50.6%，之后他們從絲瓜根際土壤分離到枯草芽孢桿菌TG26菌株[10]．該菌株對(duì)小麥赤霉病和西瓜枯萎病有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)小麥赤霉病的盆栽防效達(dá)89.8%，對(duì)西瓜枯萎病的苗期防效達(dá)100%．田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)小麥赤霉病、西瓜枯萎病的防效分別為73.1%和79.6%，并且有明顯的增產(chǎn)效應(yīng)．張學(xué)君等[11]用枯草芽孢桿菌B3菌株防治小麥紋枯病，田間防效為50%～80%，并確定了它在小麥根系及莖基部的定殖能力．

本研究采用涂布平板法和盆栽植株法測(cè)定了枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)灰霉菌菌絲的抑制作用．比較兩種方法的結(jié)果，篩選出防治黃瓜灰霉病效果較好的菌株BS03．

盆栽植株法對(duì)灰霉菌的防治效果低于涂布平板法的抑菌效果．產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的原因有三點(diǎn)：一是環(huán)境因素的影響．因?yàn)榕柙灾仓攴y(cè)定是在活體植株的葉片上，外界環(huán)境影響菌株的生長繁殖以及菌株之間可能產(chǎn)生相互作用．二是枯草芽孢桿菌的作用機(jī)理為與病原菌競爭營養(yǎng)和空間，對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用或?qū)χ参锏恼T導(dǎo)作用等．因此，枯草芽孢桿菌在植物葉片上的定植、在葉片上接種病原菌的時(shí)間、枯草芽孢桿菌的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液的pH等對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果影響很大．而涂布平板法是病原菌和枯草芽孢桿菌之間的作用，相對(duì)來說影響因素少．三是供試樣品僅為發(fā)酵液而不是制劑化產(chǎn)品，其在葉片上的黏附性及穩(wěn)定性需要助劑來增強(qiáng)．

菌株BS03發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抑菌作用，室內(nèi)盆栽植株實(shí)驗(yàn)的防病效果在50%以上，對(duì)田間實(shí)驗(yàn)具有一定的意義．另外用新鮮的培養(yǎng)基重新懸浮菌體后表現(xiàn)出良好的抑菌效果，新鮮培養(yǎng)基既可以為菌體生長繁殖和代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，還可以在制造劑型過程和貯存過程中保護(hù)菌株．說明BS03菌懸液可將作為微生物源殺菌劑進(jìn)行深入研究．

［1］王文靜. 我國生物農(nóng)藥的現(xiàn)狀與發(fā)展建議[J]. 赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，26(6)：152-153.

［2］阮云飛，穆瑞霞，王吉慶，等. 放線菌F24發(fā)酵液對(duì)灰霉菌拮抗作用初探[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(11)：84-87.

［3］趙達(dá)，傅俊范，裘季燕，等. 枯草芽孢桿菌在植病生防中的作用機(jī)制與應(yīng)用[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(1)：46-48.

［4］Bacon C W，Yates I E，Hinton D M，et al. Biological control ofFusarium moniliformein maize [J]. Environmental Health Perspectives，2001，109(S2)：325-332.

［5］Papavizas G C，Lumsden R D. Biological control of soilborne fungal propagules[J]. Annual Review of Phytopathology，1980，18：389-413.

［6］Hwang S F，Chakravartyp P. Potential for the integrated control ofRhizoctoniaroot rot ofPisumsativumusingBacillussubtilisand a fungicide[J]. Journal of Plant Diseases and Protection，1992，99(6)：626-636.

［7］Asaka O，Shoda M. Biocontrol ofRhizoctoniasolani damping-off of tomato withBacillus subtilisRB14[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62(11)：4081-4085.

［8］Office of Pesticide Program：biopesticide[DB/OL]. 2001，http：//www. epa. gov/ pesticides/ biopesticides.

［9］王雅平，劉伊強(qiáng)，潘乃穟，等. 枯草芽孢桿菌A014菌株防治小麥赤霉病的初步研究[J]. 生物防治通報(bào)，1992，8(2)：54-57.

［10］王雅平，劉伊強(qiáng)，潘乃穟，等. 枯草芽孢桿菌TG26防病增產(chǎn)效應(yīng)的研究[J]. 生物防治通報(bào)，1993，9(2)：63-68.

［11］張學(xué)君，趙軍，王金生. 枯草芽孢桿菌B3菌株對(duì)小麥根系和莖基部的定殖作用研究[J]. 生物防治通報(bào)，1994，10(4)：171-174.

責(zé)任編輯：郎婧

Screening Bacillus subtilis against Botrytis cinerea on Cucumber and Preliminary Studies of its Inhibition Activities

LI Limei1,2，GAO Bingli2，LIU Dong1,2，LI Xinglin1
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Zhejiang Dongqi Biotech Co. Ltd.，Huzhou 313000，China)

By the combination of in-vitro plate assay and in-vivo leaf assay，the biocontrol activity of 41 Bacillus subtilis strains in-vitro over mycelial growth of B. cinerea，as well as their controlling efficacies over gray mold on cucumber leaves in pots were evaluated，so as to screen the strains which could inhibit the mycelial growth of B. cinerea. The results indicated that B. subtilis BS01 and BS03 were identified to have the strongest ability to control the cucumber gray mold. While the cell concentration of both BS01 and BS03 had 50% of effect in plate assay，the cell concentration of BS03 was lower. But BS03 appeared to have better effect. The controling efficacy of BS03 in-vivo leaf assay revealed that the cell suspension displayed a higher control efficacy than supematant. The cell suspension was used on cucumber leaves. After two days，the pathogen was inoculated，and the inhibition activity was then the highest.

gray mold；biopesticides；Bacillus subtilis

Q939.96

：A

：1672-6510(2012)03-0010-05

2011–10–21；

2012–02–08

李麗梅（1985—），女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生；通信作者：李興林，副教授，lxlszf@tust.edu.cn.