劉 凱，劉逸寒，張 艷，田 耀，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的異源表達(dá)

劉 凱，劉逸寒，張 艷，田 耀，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

以野生型枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得帶有SD序列及谷氨酸棒狀桿菌信號肽ΔS0949的BTG基因．將其與大腸桿菌–谷氨酸棒狀桿菌穿梭表達(dá)載體pXMJ19連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-Sbtg轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032．經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后該重組菌發(fā)酵液具有交聯(lián)酪蛋白的能力，表明該重組菌能夠?qū)崿F(xiàn)分泌表達(dá)．

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；谷氨酸棒狀桿菌；信號肽；分泌表達(dá)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，EC 2.3.2.13，簡稱TG或TGase)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶．TG作為酰基受體與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的ε–氨基作用，形成ε–(γ–谷氨酰)Lys鍵，催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)，從而改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，在肉制品、魚類制品、豆制品、面食和乳制品等食品加工業(yè)以及紡織和生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1–6]．

目前，食品工業(yè)中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的主要生產(chǎn)方法是通過茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraensis)直接發(fā)酵獲得，由于酶活收率較低(僅為37%)[7]使其價格居高不下．雖然以日本的味之素公司科研人員為代表的中外學(xué)者對茂源鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Streptomyces mobaraensis transglutaminase，MTG)進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)使用谷氨酸棒狀桿菌作為表達(dá)宿主，將MTG的酶原區(qū)基因和激活該酶原的蛋白酶基因同時轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后能夠大量表達(dá)MTG[8–9]，之后不斷研究通過分子生物學(xué)技術(shù)改進(jìn)酶的活力，先后采用嵌合前肽替代自身前肽[10]、親水表面熱區(qū)區(qū)域趨向突變(WASH-ROM)理性進(jìn)化和隨機(jī)突變的非理性分子進(jìn)化技術(shù)[11]，在提高酶的活力的同時，對酶的突變體的構(gòu)效關(guān)系以及底物特異性進(jìn)行了詳細(xì)的分析，肯定了隨機(jī)突變是提高酶比活力的有效手段，確定了影響酶活力的關(guān)鍵氨基酸．同時證明了C. ammoniagenes ATCC6872等棒狀桿菌屬微生物都是表達(dá)外源蛋白的良好宿主[12]，但MTG一些特性(諸如：pH和溫度等)對一些加工底物和加工過程的需求不能很好滿足[13]，使得開發(fā)不同種類和特性的TG成為食品加工業(yè)發(fā)展的一個必然趨勢．而枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Bacillus subtilis transglutaminase，簡稱BTG)則能較好地彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)．1996年日本的Kobayashi等[14]最早在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了BTG，同時克隆出BTG基因，研究其分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)BTG沒有信號肽．而Suzuki等通過對BTG進(jìn)行分離和特性研究，證明該酶相對分子質(zhì)量約為2.9×104，最適作用溫度為60,℃，最適pH 8.2，能分別催化酪素液及BSA蛋白分子的交聯(lián)和凝膠化[15]．關(guān)于BTG的研究目前主要以大腸桿菌(Escherichia coli)為表達(dá)宿主，主要存在表達(dá)量不高[16]，產(chǎn)物極易形成包涵體等問題，而關(guān)于該酶分泌表達(dá)的報道則極少．

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)目前主要用于工業(yè)化生產(chǎn)谷氨酸和賴氨酸等各類氨基酸[17]．以谷氨酸棒狀桿菌作為表達(dá)宿主有著極其明顯的優(yōu)勢：擁有一套高效的分泌信號肽及分子伴侶系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制、遺傳背景較清楚，從而能夠高效分泌目的蛋白，也簡化了目的蛋白的分離純化，而且在多數(shù)情況下，谷氨酸棒狀桿菌分泌的重組異源蛋白具有天然構(gòu)象和生物活性[18]；谷氨酸棒狀桿菌分泌的蛋白酶極少，幾乎不會對表達(dá)的蛋白造成影響；谷氨酸棒狀桿菌嚴(yán)格好氧，生長迅速，培養(yǎng)條件簡單，使用安全，無致病性，作為表達(dá)宿主時間久，人們積累了極其豐富的發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)．這些都說明谷氨酸棒狀桿菌是一種優(yōu)良的食品用酶表達(dá)宿主．

本實(shí)驗(yàn)旨在通過構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)BTG的分泌表達(dá)，為未來BTG的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)JM110、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCCA13032、野生型枯草芽孢桿菌(wild type Bacillus subtilis)、質(zhì)粒pXMJ19均為本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2 主要試劑和工具酶

Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和PstⅠ，Takala公司；DNA純化回收和質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0．

LA培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，瓊脂粉20，pH 7.0～7.2．

谷棒復(fù)蘇培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，葡萄糖5，pH 7.0～7.2．

1.1.4 引物合成

根據(jù)GenBank中枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列(登錄號為：E13095)，參考谷氨酸棒狀桿菌信號肽篩選的結(jié)果[19]，設(shè)計(jì)一段含SD序列及全長信號肽序列ΔS0949的BTG基因，該信號肽為Keiro W等在野生型谷氨酸棒狀桿菌基因組中篩選出的具有高效分泌能力的信號肽0949的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化切割位點(diǎn)的首個氨基酸，將原始信號肽的首個氨基酸亮氨酸(L)改為谷氨酰胺(Q)得到的．引物設(shè)計(jì)為：上游引物P1：5′-TATCGGCGCTGCCAGCATGTTTAT GCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCATCGAGAT GATTATTGTATCAGGACAA-3′，上游引物P2：5′-CCCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGCAAATA AACCGCCGAGGCTTCTTAAAAGCCACCGCAG GACTTGCCACTATCGGCGCTGCCAG-3′，下游引物P3：5′-AAAACTGCAGTTAGCGGACGATGCG-3′.上游引物P1除互補(bǔ)序列外還含有信號肽序列ΔS0949的下游49個堿基序列，上游引物P2的5′端引入了HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT)，含有信號肽序列ΔS0949的上游50個堿基序列及全長SD序列；下游引物P3的5′端引入了PstⅠ酶切位點(diǎn)(CTGCAG).引物委托上海英俊生物工程有限公司合成．

1.2 方法

1.2.1 野生型枯草芽孢桿菌染色體DNA的提取

接1環(huán)枯草芽孢桿菌單菌落于5,mL LB液體培養(yǎng)基，180,r/min、37,℃培養(yǎng)過夜；取1,mL菌液于1.5,mL的EP管中，離心去上清液，用500,μL去離子水重懸菌體，加溶菌酶至終質(zhì)量濃度50,μg/mL，37,℃放置30,min；加10% SDS 100,μL，混勻，放置10,min左右直至黏稠；然后加入5,mol/L NaCl 100,μL，充分混勻，放置10,min；再加入體積比為1﹕1的苯酚與氯仿混合溶液700,μL，劇烈振蕩，離心10,min；直至兩界面澄清．用2倍體積無水乙醇沉淀DNA，12,000,r/min離心10,min，棄上清液，充分晾干；然后加50,μL去離子水溶解DNA，–20,℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 含SD序列及信號肽ΔS0949的btg基因擴(kuò)增

以野生型枯草芽孢桿菌染色體為模板，首先用引物P1、P3擴(kuò)增目的基因，然后以該擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以P2、P3為引物擴(kuò)增出含SD序列及全長信號肽序列ΔS0949的BTG基因；擴(kuò)增循環(huán)條件：95,℃預(yù)變性5,min，94,℃變性30,s，65,℃退火30,s，72,℃延伸1,min，30個循環(huán)．

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物純化回收后用HindⅢ和PstⅠ雙切后與同樣經(jīng)過HindⅢ和PstⅠ雙切的質(zhì)粒pXMJ19連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM110，涂布含氯霉素質(zhì)量濃度為50,μg/mL的平板，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示．

圖1 重組質(zhì)粒pXMJ19-Sbtg構(gòu)建流程圖Fig. 1 Construction of pXMJ19-Sbtg

1.2.4 谷氨酸棒狀桿菌的電轉(zhuǎn)化

接種新鮮的對數(shù)期菌液至含0.1%吐溫80和3%甘氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600約為0.9時取出搖瓶，冰浴15,min，4,℃、8,000,r/min離心10,min．用預(yù)冷的10%甘油洗滌菌體4次，最后用10%甘油重懸菌體，分裝保存．取50,μL感受態(tài)細(xì)胞和2,μL構(gòu)建好的重組質(zhì)?；靹颍杆偌尤腩A(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中電擊．電擊條件為電壓2.5,kV，電阻400,?，電容200,μF．電擊結(jié)束后迅速取出電轉(zhuǎn)杯，加入LB培養(yǎng)基1,mL，46,℃熱擊6,min，30,℃振蕩培養(yǎng)1,h，取200,μL涂布于含10,μg/mL氯霉素的LB抗性平板．挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證．

1.2.5 目的基因在谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中的表達(dá)

接1環(huán)重組菌單菌落于裝有50,mL LB培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，30,℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100,mL LB培養(yǎng)基的500,mL三角瓶中，30,℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)8,h，加入終濃度為1,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)48,h．發(fā)酵液于12,000,r/min離心5,min，取1,mL上清液，向其中加入100%TCA 130,μL，–20,℃放置30,min，4,℃沉淀12,h，12,000,r/min離心5,min，棄去上清液，加1,mL丙酮洗滌，待丙酮揮發(fā)完全后向沉淀中加入30 μL電泳上樣緩沖液，沸水浴5,min，12,000,r/min離心10,min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析．

1.2.6 酪蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)

用0.1,mol/L Tris·Cl(pH 7.5)配制1,mg/mL酪蛋白溶液．將酪蛋白溶液與粗酶液按一定比例混合，再加入DTT至終濃度為5,mmol/L，于37,℃反應(yīng)過夜．反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測．

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以野生型枯草芽孢桿菌染色體為模板，分別用引物P1、P3和P2、P3擴(kuò)增目的基因Sbtg．由于在引物合成過程中，在btg的上游外源添加了一段SD序列和谷氨酸棒狀桿菌的高效分泌信號肽序列ΔS0949，使得btg具有了在谷氨酸棒狀桿菌中能夠分泌表達(dá)的潛力．PCR產(chǎn)物純化回收后用HindⅢ和PstⅠ雙切，后與同樣經(jīng)過HindⅢ和PstⅠ雙切的質(zhì)粒pXMJ19連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM110，涂布含氯霉素質(zhì)量濃度為50,μg/mL的平板，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證(圖2)．經(jīng)HindⅢ和PstⅠ雙切，重組質(zhì)粒產(chǎn)生6,600,bp和850,bp的兩條帶，與預(yù)計(jì)大小相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功．

2.2 谷氨酸棒狀桿菌的電轉(zhuǎn)化及鑒定

鑒于谷氨酸棒狀桿菌具有非常強(qiáng)的限制系統(tǒng)，能有效降解來自不同菌種的異源 DNA或被異源甲基化修飾的 DNA，使得在普通大腸桿菌中構(gòu)建的重組DNA對谷氨酸棒狀桿菌的電轉(zhuǎn)化效率不高，因此，首先在甲基化修飾缺陷系統(tǒng)的大腸桿菌菌株JM110中構(gòu)建好重組質(zhì)粒pXMJ19-Sbtg，利用該質(zhì)粒的大腸桿菌–谷氨酸棒狀桿菌穿梭特性轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌，可提高其轉(zhuǎn)化效率．提取JM110中構(gòu)建好的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氯霉素10,μg/ mL 的LA抗性平板．挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證．

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Idenfication of recombined vector by digestion with HindⅢ and PstⅠ

2.3 重組菌pXMJ19-Sbtg/13032的誘導(dǎo)表達(dá)

將未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)48,h后的重組菌株和對照菌株pXMJ19/13032發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE(圖3)．通過測序結(jié)果推測，目的蛋白的相對分子質(zhì)量應(yīng)該為2.7×104，但電泳結(jié)果顯示，重組菌株pXMJ19-Sbtg/13032及對照菌株pXMJ19/13032均未見明顯的目的條帶出現(xiàn)，推測原因：活性形式的BTG由于其交聯(lián)作用會對菌體產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致該蛋白的表達(dá)量不高．

圖3 重組蛋白的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombined protein

2.4 酪蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)

分別將誘導(dǎo)前后重組菌及對照菌pXMJ19/13032發(fā)酵液過濾除菌后與配制的酪蛋白溶液混合，37,℃反應(yīng)過夜后可見重組菌發(fā)酵液變渾濁，有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，而對照菌發(fā)酵液則依然為澄清狀態(tài)．取反應(yīng)液SDS-PAGE分析(圖4)，結(jié)果表明與重組菌發(fā)酵液混合的酪蛋白經(jīng)過BTG的交聯(lián)作用產(chǎn)生相對分子質(zhì)量極大的聚合體，該聚合體無法進(jìn)入濃縮膠內(nèi)，而對照菌則未發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)．這表明重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后BTG得到了表達(dá)．

圖4 酪蛋白交聯(lián)產(chǎn)物SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE analysis of cross-linked polymer

3 結(jié) 語

枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(BTG)作為谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶家族中較為特殊的一種，由于其相對分子質(zhì)量較小(約2.8×104)及比活力較高，從而具有巨大的潛在應(yīng)用價值．大腸桿菌由于產(chǎn)內(nèi)毒素和易形成包涵體等局限，無法達(dá)到食品級用酶嚴(yán)格的生產(chǎn)要求，而谷氨酸棒狀桿菌則無此局限，是生產(chǎn)該酶潛在的優(yōu)良宿主．由于天然存在的BTG是胞內(nèi)酶，不含信號肽序列，無法得到分泌表達(dá)，故參閱相關(guān)文獻(xiàn)，利用一段適于谷氨酸棒狀桿菌高效分泌表達(dá)的信號肽序列ΔS0949，將其與BTG基因連接，得到了能分泌表達(dá)BTG的重組谷氨酸棒狀桿菌．目前還沒有關(guān)于特異性測定BTG酶活的方法，而氧肟酸比色法[20]是測定茂源鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活的特異方法，但無法使用該方法測出BTG的酶活，推測可能原因?yàn)椴煌瑏碓吹墓劝滨０忿D(zhuǎn)氨酶的底物要求不同造成的，尋找特異性底物對BTG的表達(dá)量進(jìn)行定量分析成為下一步工作的重點(diǎn)．

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責(zé)任編輯：郎婧

Heterogeneous Expression of Bacillus subtilis Transglutaminase

LIU Kai，LIU Yihan，ZHANG Yan，TIAN Yao，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

GeneSbtgwith SD sequence and signal peptide ΔS0949Corynebacterium glutamicumwas obtained from the genomic DNA of wild typeBacillus subtilisthough PCR amplification. It was then inserted into anE. coli-C. glutamicumshuttle vector pXMJ19 to construct expression plasmid pXMJ19-Sbtg. The recombined plasmid was then transformed intoCorynebacterium glutamicumATCC13032. Induced by IPTG，the fermentatiom broth had a cross-linking ability. The result indicated that gene Sbtg was a secretion expression.

transglutaminase；Corynebacterium glutamicum；signal peptide；secretion expression

Q814.4

：A

：1672-6510(2012)03-0001-05

2011–12–16；

2012–01–22

“863”“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題資助(2011AA100905-4)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21076159)

劉 凱（1986—），男，山東泰安人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn．