楊紅霞，常 蕓

反復(fù)性力竭運動后大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1的變化及其在運動性心律失常發(fā)生中的作用

楊紅霞，常 蕓

目的：探討反復(fù)力竭運動后不同時相心臟竇房結(jié)、房室結(jié)和浦肯野氏纖維細(xì)胞炎性因子金屬蛋白酶-1基因和蛋白水平的表達(dá)特點，為運動性心律失常發(fā)生機制的闡明提供實驗依據(jù)。方法：100只健康成年雄性SD大鼠隨機分為反復(fù)力竭組及相應(yīng)的其對照組，每組10只。分別于

力竭運動后0、4 h、12 h及24 h取材，進行心電圖、免疫熒光組化及實時熒光定量PCR分析。應(yīng)用激光顯微切割技術(shù)定位并收集房室結(jié)和浦肯野氏纖維細(xì)胞研究細(xì)胞炎性因子ADAMTS-1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：反復(fù)力竭運動后即刻心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高，隨后在4 h、12 h、24 h心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1基因mRNA和蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01），乃至恢復(fù)。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運動后ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)存有差異，其中，運動后即刻，浦肯野氏纖維ADAMTS-1蛋白表達(dá)顯著低于竇房結(jié)和房室結(jié)（P＜0.01）。4 h，竇房結(jié)顯著高于浦肯野氏纖維（P＜0.01）。24 h，竇房結(jié)顯著低于房室結(jié)和浦肯野氏纖維（P＜0.01）。結(jié)論：反復(fù)力竭運動后即刻心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高，作為炎性因子的大量表達(dá)，易引起傳導(dǎo)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間質(zhì)增

殖乃至纖維化，是運動性心律失常的誘發(fā)因素之一。

力竭運動；金屬蛋白酶-1；心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)

運動性心律失常一直是運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題。而運動性心律失常的發(fā)生機制是一個極其復(fù)雜的過程，涉及眾多因子。運動醫(yī)學(xué)界對此進行了廣泛的臨床觀察與調(diào)研[1]。常蕓等針對運動性心律失常的發(fā)生機制進行了大量實驗性研究[2-4]。目前運動性心律失常發(fā)生的可能原因仍未完全闡明，以往實驗性研究方法，大多數(shù)集中心肌組織，很難概括心律失常發(fā)生的病理機制。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)作為心電活動的控制中心和沖動傳導(dǎo)的重要部位，其特殊的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型決定其具有不同于普通心肌的心電起搏和傳導(dǎo)功能，與各種類型心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系。

金屬蛋白酶（ADAMTS）是新近發(fā)現(xiàn)的具有蛋白質(zhì)水解功能的金屬蛋白酶家族，I型血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-1）是ADAMTS家族成員，屬于分泌型蛋白，可由巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌[5]有研究表明[6]ADAMTS-1可能通過調(diào)節(jié)膠原代謝參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，可能與運動性心律失常的病理過程有關(guān)。而在運動條件下心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中ADAMTS-1的變化還未見報道。

為此，本研究將對反復(fù)力竭運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的ADAMTS-1在基因和蛋白表達(dá)變化進行研究，試圖為運動性心律失常發(fā)生機制的闡釋提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

健康雄性成年SD大鼠100只，8周齡，體重（22.0±8）g。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（20±2）℃，光照時間12 h，相對濕度40%～55%。

1.2 運動負(fù)荷

將100只實驗大鼠隨機分為10組，每組10只。其中一次力竭和2周反復(fù)力竭游泳運動[7]各4組，相應(yīng)安靜對照2組。安靜對照組不運動，力竭運動各組大鼠尾部負(fù)重為體重的3%，每周運動6天，每天1次。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas的報道[8]即：“經(jīng)過10 s后動物仍不能返回水面，并且撈出后置于平面不能完成翻正反射?！?/p>

1.3 取材

最后一次力竭運動后即刻、4 h、12 h及24 h等不同時相取材，迅速取出心臟，沿心臟矢狀面的方向?qū)⒄麄€心臟用OCT包埋，液氮驟冷，作全心連續(xù)冰凍切片，光鏡定位心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，運用激光顯微切割儀切割分別收集竇房結(jié)細(xì)胞或細(xì)胞團[9]。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，存于-20℃?zhèn)溆?。通過互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找目標(biāo)因子結(jié)蛋白和內(nèi)參照β-actin的引物基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件進行引物設(shè)計，引物擴增目標(biāo)基因片斷長度均小于150 bp，其PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證引物可用后，再進行熒光定量 PCR，取定量PCR用 96孔板，加入cDNA和引物配置25μ L反應(yīng)體系。實時定量RT-PCR主要過程：預(yù)變性95℃ 30 s，PCR反應(yīng)95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。檢測CT值（見表1）。設(shè)計的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR引物序列TableⅠ PCR Primer Sequence

1.5 免疫熒光檢測

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)冰凍切片進行免疫熒光組織化學(xué)染色，采用Leica AD MDW活細(xì)胞多維圖成像工作站和Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對目標(biāo)因子蛋白熒光強度進行定量，熒光強度用積分灰度表示（IOD），參考陰性對照標(biāo)本中熒光強度，灰度值在40～130之間為蛋白陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SDS2.2軟件對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行分析處理，并導(dǎo)出文件及圖像。利用管家基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進行校正，得到相對定量結(jié)果（相對數(shù)值）。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用多因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)一般指標(biāo)

經(jīng)過反復(fù)力竭運動后大鼠有不同程度出現(xiàn)心律失常，心臟肉眼觀察有不同程度的充血，且反復(fù)力竭游泳運動后各時相組心臟重量指數(shù)均顯著高于對照組心臟重量指數(shù)（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)結(jié)果參見［10］。

2.2 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1mRNA表達(dá)結(jié)果

如表2所示，反復(fù)力竭游泳運動后即刻心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)ADAMTS-1基因mRNA表有所增高，隨后在4 h、12 h、24 h心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1基因mRNA表達(dá)均顯著低于對照組（P＜0.05），4 h又顯著低于12 h（P＜0.05）；其中，反復(fù)力竭游泳運動后4 h、12 h房室結(jié)ADAMTS-1mRNA表達(dá)顯著低于即刻和24 h（P＜0.05）；反復(fù)力竭游泳運動后4 h、12 h浦肯野氏纖維ADAMTS-1mRNA表達(dá)顯著低于即刻（P＜0.05）。

總體來看，反復(fù)力竭運動后大鼠傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位ADAMTS-1基因mRNA表達(dá)呈時相性規(guī)律，反復(fù)力竭運動后即刻大鼠竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1基因mRNA表達(dá)上升，之后迅速下降，到力竭后4 h接近低谷，一直持續(xù)到24 h，其中，竇房結(jié)和房室結(jié)的改變更為明顯（見圖1）。

2.3 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1蛋白表達(dá)結(jié)果

如表3所示，經(jīng)反復(fù)力竭游泳運動后，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)ADAMTS-1蛋白表達(dá)即刻顯著高于對照組（P＜0.01），4 h、12 h、24 h又均顯著低于對照組和即刻（P＜0.01）。

房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1蛋白表達(dá)4 h、12 h、24 h均顯著低于對照組和即刻（P＜0.01），4 h又顯著低于12 h（p＜0.05）和24 h（P＜0.01）。其中，房室結(jié)ADAMTS-1蛋白表達(dá)即刻顯著高于對照組（P＜0.01），浦肯野氏纖維ADAMTS-1蛋白表達(dá)24 h顯著高于12 h（P＜0.01）。

表2 反復(fù)力竭運動后大鼠ADAMTS-1mRNA相對表達(dá)量TableⅡ Relative Expression Quantity of Rat ADAMTS-1mRNA after Repeated Exhaustive Exercise

表3 反復(fù)力竭運動后大鼠ADAMT S-1蛋白表達(dá)總灰度值變化情況TableⅢ Changes of Total Gray Value of Rat ADAMTS-1 Protein Expression after Repeated Exhaustive Exercise

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運動后存有差異。其中即刻，浦肯野氏纖維ADAMTS-1蛋白表達(dá)顯著低于竇房結(jié)和房室結(jié)（P＜0.01）。4 h，竇房結(jié)顯著高于浦肯野氏纖維（P＜0.01）。24 h，竇房結(jié)顯著低于房室結(jié)和浦肯野氏纖維（P＜0.01）。

總體來看，反復(fù)力竭運動后大鼠傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位ADAMTS-1基因蛋白表達(dá)呈時相性規(guī)律，運動后即刻大鼠竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1基因蛋白表達(dá)上升，之后迅速下降，到力竭后4 h接近低谷，一直持續(xù)到24 h，其中，竇房結(jié)和房室結(jié)的改變更為明顯（見圖2）。

3 討論

ADAMTS是新近發(fā)現(xiàn)的具有蛋白質(zhì)水解功能的金屬蛋白酶家族，I型血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-1）是ADAMTS家族成員，屬于分泌型蛋白，可由巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌[5]，分泌后大多通過C末端3個TSP重復(fù)序列和間隔區(qū)錨定在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中，并與之結(jié)合從而參與ECM蛋白的調(diào)節(jié)[6、11]。有研究表明，ADAMTS-1參與動脈粥樣硬化的病理過程與ECM重構(gòu)關(guān)系密切，具有降解I型膠原的作用[12]。申鍔，陳瑞珍等[13]研究表明ADAMTS-1可能通過調(diào)節(jié)膠原代謝而參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。也有學(xué)者觀察柯薩奇病毒B組病毒感染小鼠引起急、慢性病毒心肌炎心肌ADAMTS-1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-1與CVB3感染所致病毒性心臟病心肌纖維化關(guān)系密切[14]。在運動條件下房室結(jié)和浦肯野纖維細(xì)胞中ADAMTS-1的變化還未見報道。

馮小蘭、馮震博[15]利用結(jié)扎后造成心肌梗死模型，研究大鼠急性心肌梗死（AMI）ADAMTS-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎后6 h，ADAMTS-1 mRNA的表達(dá)到高峰，在ADAMTS-1表達(dá)高的區(qū)域出現(xiàn)心肌壞死，提示ADAMTS-1表達(dá)高的區(qū)域，心肌損害程度越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)力竭運動后大鼠傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位ADAMTS-1基因mRNA表達(dá)呈時相性規(guī)律，反復(fù)力竭運動后即刻大鼠竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維ADAMTS-1基因mRNA表達(dá)上升，之后迅速下降，到力竭后4 h接近低谷，一直持續(xù)到24 h，其中，竇房結(jié)和房室結(jié)的改變更為明顯。ADAMTS-1具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使酶活性喪失，糖蛋白分解，細(xì)胞功能的損壞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡或壞死。分析認(rèn)為，反復(fù)運動后心肌缺血再灌注損傷加重。由于對反復(fù)力竭刺激產(chǎn)生適應(yīng)，在運動后24 h的ADAMTS-1表達(dá)有所恢復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)[16]，TNF-a可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ADAMTS-1，從而分泌到細(xì)胞外基質(zhì)并與之結(jié)合,參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的調(diào)節(jié)，降解蛋白多糖，聚集蛋白聚糖、多能聚糖以及膠原蛋白[17]，引起心肌組織局部肌肉間隙增寬，導(dǎo)致心肌組織結(jié)構(gòu)改變，最終影響心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)力竭運動后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且運動后4 h、12 h浦肯野氏纖維ADAMTS-1mRNA表達(dá)顯著低于即刻，故反復(fù)力竭后運動性室性心律失常的易感性更高。綜上，反復(fù)力竭運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高，可能影響正常心律的起搏與傳導(dǎo)，構(gòu)成運動性心律失常的發(fā)生基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

4.1 反復(fù)力竭運動后即刻心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高，作為炎性因子的大量表達(dá)，易引起傳導(dǎo)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間質(zhì)增殖乃至纖維化，是運動性心律失常的誘發(fā)因素之一。

4.2 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運動后ADAMTS-1 mRNA和蛋白表達(dá)存有差異，其中運動后即刻浦肯野氏纖維ADAMTS-1蛋白表達(dá)顯著低于竇房結(jié)和房室結(jié)，而運動后4 h竇房結(jié)顯著高于浦肯野氏纖維，24 h竇房結(jié)顯著低于房室結(jié)和浦肯野氏纖維。

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(責(zé)任編輯：何聰)

Changes of ADAMTS-1 of the Rat Cardiac Conduction System after Repeated Exhaustive Exercise and Its Role in Athletic Arrhythmia

YANG Hong-xia, CHANG Yun
(China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Objective To find out the expressive characteristics of sinoatrial node, atrioventricular node and Purkinje's fibre cell inflammatory factor MMP-1 gene and protein level at the different phases after repeated exhaustive exercises so as to provide experimental reference for the occurrence mechanism of athletic arrhythmia. Method 100 healthy adult male SD rats were divided randomly into repeated exhaustive exercise groups and control groups. There are 10 rats in each group. Samples were collected immediately, 4h, 12h and 24h after the exhaustive exercise for electrocardiogram, immunofluorescence technology and PCR analysis. Adopting microdissection technology to position and collect the changes of cardiac conduction system ADAMTS-1 mRNA and protein expression of atrioventricular node and Purkiny's fibre cell inflammatory factor ADAMTS-1. Result Cardiac conduction system ADAMTS-1 mRNA and protein expression immediately after repeated exhaustive exercise rose to some extent. Then the cardiac conduction system sinoatrial node, atrioventricular node and Purkinye's fibre ADAMTS-1 mRNA and protein expression decreased at 4h, 12h and 24 hours (P<0.05, P<0.01) until recovery. There is a difference between ADAMTS-1 mRNA and protein expression of the different parts of cardiac conduction system after repeated exhaustive exercise. Purkinye's fibre ADAMTS-1 protein expression was clearly lower than those of sinoatrial node and atrioventricular node immediately after the exercise (P<0.01). After 4 hours, protein expression of sinoatrial node was significantly higher than that of Puekinye's. After 24 hours, The protein expression of sinoatrial node was evidently lower than those of atrioventricular node and Purkinye's fibre (P<0.01). Conclusion ADAMTS-1 mRNA and protein expression rose to some extent immediately after repeated exhaustive exercise. Large quantity expression of inflammatory factor may cause inflammatory cell filtration , Intercellular substances proliferation and fibrosis. This is one of the risk factors for athletic arrhythmia.

exhaustive exercise; MMP-1; cardia conduction system

G804.5

A

1006-1207(2012)04-0021-04

2012-06-27

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費（10-01）

楊紅霞，女，研究生. 主要研究方向：運動心臟病理與醫(yī)學(xué)監(jiān)督.

國家體育總局體育科學(xué)研究所，北京體育館路11號，北京100061