徐 歆 毛予龍 李雅麗 胡勝蘭 吳紅照 李衛(wèi)芬

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所，教育部動物分子營養(yǎng)學(xué)重點實驗室，杭州 310058)

動物機體因氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，卻又存在著一套完善的抗氧化系統(tǒng)，防止自由基的過度累積，從而使自由基處于動態(tài)平衡之中，機體得以避免氧化損傷。當(dāng)因應(yīng)激而打破該平衡，致使自由基積累時，機體便處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而使細(xì)胞內(nèi)大分子(如脂類、蛋白質(zhì)和核酸)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能受到損害［1］。過多的能量攝入可提高機體代謝水平，顯著增加體內(nèi)自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激［2］。所以飼喂高脂飼糧的小鼠常用作研究氧化應(yīng)激的動物模型［3］。益生菌能夠通過促進(jìn)動物腸道內(nèi)的菌群平衡，發(fā)揮促生長和提高抗病力等益生作用，因此已被開發(fā)為安全、有效的活菌制劑且廣泛應(yīng)用于各種畜禽和水產(chǎn)動物飼料中，并取得了良好效果。同時，部分益生菌(如乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌)還被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗氧化作用。目前，關(guān)于芽孢桿菌抗氧化作用的報道不多。研究表明，納豆芽孢桿菌可顯著提高早期斷奶仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性，顯著降低血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量［4］;枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞血清與肝臟總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)和 GSH－Px 活性，顯著降低其血清MDA、一氧化氮和肝臟 MDA含量［5］?？梢?，芽孢桿菌能夠增強正常狀態(tài)下動物的抗氧化功能。不過，關(guān)于氧化應(yīng)激狀態(tài)下該益生菌對動物抗氧化功能的影響，仍有待研究。枯草芽孢桿菌B1是本實驗室篩選得到的一株具有良好抗氧化作用的芽孢桿菌。本試驗旨在探討該菌株對飼喂高脂飼糧小鼠抗氧化功能的影響，從而為進(jìn)一步明晰芽孢桿菌的抗氧化機理提供試驗基礎(chǔ)，也為相關(guān)活菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

試驗材料包括枯草芽孢桿菌B1制劑(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所微生物與基因工程實驗室制備，活菌數(shù)為108CFU/g)、普通ICR雄性小鼠、基礎(chǔ)飼料(浙江大學(xué)試驗動物中心提供)。

試驗設(shè)備包括DK－8D恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、5804R高速冷凍離心機(德國 Eppendorf公司)、T10 basic分散機(德國IKA公司)、SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

將45只(35±1)g的ICR小鼠隨機分為3組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5只。分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、高脂飼糧(5.0%豬油+2.0%膽固醇+0.2%膽鹽+92.8%基礎(chǔ)飼糧，高脂組)和高脂飼糧+0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))枯草芽孢桿菌B1制劑(試驗組)。每籠5只小鼠，定期更換墊料和飲水，自由采食、充足飲水，溫度25℃，濕度55%，光照12 h/d，飼養(yǎng) 30 d。

1.2.2 樣品收集與制備

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，每個重復(fù)隨機挑選2只，乙醚麻醉，眼球采血。促凝采血管收集血液，37℃水浴2 h，4℃靜置12 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上層透明淡黃色液體(即血清)至1.5 mL離心管，－80℃凍存。小鼠采血后立即頸椎脫臼處死，解剖，取肝臟和小腸。清除小腸內(nèi)容物后，縱向剖開，刮取內(nèi)層黏膜。取腸黏膜和肝臟各0.5 g，按質(zhì)量體積比1∶10加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水，在冰浴條件下進(jìn)行充分勻漿，2 000 r/min離心 15 min，收集上清至1.5 mL離心管，－80℃凍存。

1.2.3 指標(biāo)測定

測定血清、腸黏膜和肝臟抗氧化功能相關(guān)指標(biāo)，如下:T－AOC、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、GSH－Px活性、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量、抗超氧陰離子自由基(superoxide anion radical，·)活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)活性、8 － 羥基脫氧鳥苷(8－h(huán)ydroxydeoxyguanosine，8－OHdG)含量，其中8－OHdG含量僅針對組織勻漿樣品。以上指標(biāo)均使用試劑盒按操作說明書進(jìn)行測定，T－AOC、SOD、GSH－Px、GSH、抗·、CAT、MDA、XOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TrxR和8－OHdG試劑盒購自上海拜力生物有限公司。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件中的one－way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌B1對高脂飼糧小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響

由表1可知，3個組的小鼠腸黏膜抗氧化功能各有差異。與對照組相比，高脂組腸黏膜T－AOC減少了28.34%(P＜0.01)，CAT活性降低了7.26%(P＞0.05)，GSH含量升高了 49.86%(P＜0.01)，8－OHdG 含量增加了 9.42%(P ＞0.05);與高脂組相比，試驗組腸黏膜 T－AOC和MDA含量分別增加了32.44%(P＜0.05)和50.00%(P＜0.01)，GSH－Px活性和GSH含量分別減少了48.58%(P＜0.01)和22.88%(P ＜0.05)，XOD 活性和8－OHdG含量也分別下降了18.42%(P＞0.05)和6.86%(P＞0.05)。上述結(jié)果提示，高脂飼糧可顯著降低小鼠腸黏膜的T－AOC;添加枯草芽孢桿菌B1能顯著提高高脂飼糧小鼠腸黏膜的T－AOC，顯著降低部分抗氧化酶的活性。

表1 枯草芽孢桿菌B1對高脂飼糧小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響Table 1 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in intestinal mucosa of mice fed a high－fat diet

2.2 枯草芽孢桿菌B1對高脂飼糧小鼠肝臟抗氧化功能的影響

由表2可知，3個組的小鼠肝臟抗氧化功能各有差異。與對照組相比，高脂組肝臟 SOD、GSH－Px、CAT、TrxR 活性和 T－AOC 分別降低了22.91%(P ＜0.05)、37.35%(P ＜0.01)、47.47%(P＜0.01)、36.42%(P＜0.05)和14.29%(P＞0.05)，8－OHdG含量顯著增加了 67.87%(P＜0.01);與高脂組相比，試驗組肝臟 GSH含量、CAT和TrxR活性分別提高了38.27%(P＜0.05)、53.01%(P＜0.05)和28.13%(P＞0.05)，T－AOC、MDA 與 8－OHdG 含量和 XOD 活性分別顯著下降21.43%(P＜0.05)、16.01%(P＜0.05)、37.52%(P＜0.01)和16.25%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，高脂飼糧能降低小鼠肝臟抗氧化酶活性，增加8－OHdG含量;添加枯草芽孢桿菌B1能緩解高脂飼糧對小鼠肝臟的抗氧化能力的削弱，提高部分抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量。

表2 枯草芽孢桿菌B1對小鼠肝臟抗氧化功能的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in liver of mice fed a high－fat diet

2.3 枯草芽孢桿菌B1對高脂飼糧小鼠血清抗氧化功能的影響

由表3可見，3個組的小鼠血清抗氧化功能均有所差異。與對照組相比，高脂組血清GSH含量、GSH－Px和抗·活性分別下降了30.73%(P＜0.01)、47.26%(P＜0.01)和8.02%(P＜0.01)，T－AOC 提高了 9.69%(P ＜ 0.05)，MDA含量上升了6.75%(P＞0.05)。與高脂組相比，試驗組 血 清 T－AOC、GSH 含 量、GSH－Px 和 抗·活性分別提高了10.72%(P＜0.05)、38.01%(P ＜0.05)、51.98%(P ＜0.01)和13.45%(P＜0.01)，SOD活性顯著下降了11.10%(P＜0.01)，MDA含量減少了8.85%(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，飼喂高脂飼糧雖然提高了小鼠血清的T－AOC，但顯著降低了多種抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)的含量;而添加枯草芽孢桿菌B1能夠顯著增強高脂飼糧血清的T－AOC，并大幅提高大部分抗氧化酶活性。

表3 枯草芽孢桿菌B1對小鼠血清抗氧化能力的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in serum of mice fed a high－fat diet

3 討論

機體中清除自由基的系統(tǒng)包括抗氧化酶(SOD、GSH－Px、CAT 等)和非酶抗氧化劑(GSH、維生素C、維生素E等)，能捕捉和清除機體內(nèi)的大部分過氧化物［6］。T－AOC是抗氧化物質(zhì)的功能疊加，可作為衡量機體、器官或組織抗氧化功能的主要指標(biāo)。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，脂類在其中的乳化、水解及吸收均需要消耗能量，并產(chǎn)生大量自由基［7－8］。肝是機體進(jìn)行脂肪代謝的主要場所，過量的脂肪攝入令肝細(xì)胞內(nèi)豐富的線粒體產(chǎn)生大量的活性氧簇，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和肝臟抗氧化系統(tǒng)異常，進(jìn)而引起脂肪性肝炎［9－10］。血液是機體運送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的載體，其攜帶的自由基部分來源于血液中的細(xì)胞，部分來自其他器官、組織、細(xì)胞。近年研究表明，機體血液自由基水平增加，抗氧化能力下降，將導(dǎo)致血漿中的脂質(zhì)發(fā)生過氧化損傷，并與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。因此，腸道、肝臟以及血液的抗氧化能力可較為全面地反映整個機體的抗氧化功能。本試驗表明，高脂飼糧不同程度地削弱了小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，與前人的研究結(jié)果［12－15］相符。添加枯草芽孢桿菌B1能增強高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，且效果血清＞腸黏膜＞肝臟。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物之一，作為脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)反映了機體的氧化應(yīng)激水平［16］。8－OHdG被認(rèn)為是氧化應(yīng)激引起DNA氧化損傷的標(biāo)志［17］。氧化應(yīng)激狀態(tài)的評價，應(yīng)綜合考慮氧化代謝產(chǎn)物水平和氧化損傷程度［6］。本試驗結(jié)果表明，飼喂高脂飼糧可引起小鼠機體的氧化應(yīng)激，且程度肝臟＞血清＞腸黏膜;枯草芽孢桿菌B1能降低高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清的氧化應(yīng)激程度，效果肝臟＞血清＞腸黏膜，并減少腸細(xì)胞和肝細(xì)胞的DNA損傷。這提示枯草芽孢桿菌B1能通過減輕高脂引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)機體的抗氧化功能。由上可知，枯草芽孢桿菌B1在高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清中的作用方式各不相同，且抗氧化效果有所差異;該菌的抗氧化作用表現(xiàn)為增強和保護(hù)機體的抗氧化功能。

4 結(jié)論

①高脂飼糧降低了小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，并引起了不同程度的氧化應(yīng)激。

②添加枯草芽孢桿菌B1對高脂飼糧小鼠的抗氧化功能具有一定的增強作用，并能減輕機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，較好地保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷。

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