蔣純衛(wèi) 咼于明 王永偉 雷 廷 郭雙雙

(中國農業(yè)大學動物科技學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

準確估測內源氨基酸基礎損失量是測定飼料標準氨基酸消化率的一大關鍵，內源氨基酸基礎損失量的測定方法也是近年動物營養(yǎng)研究的熱點［1］。20世紀90年代，收糞法因具有簡便可行且結果較飼料直接物化分析法更有效等優(yōu)點而被廣泛采納，但也因受盲腸微生物影響一直備受爭議。當前，無氮飼糧法研究盲腸微生物對氨基酸基礎內源損失的影響主要有3種方法:完整成年公雞、去盲腸成年公雞強飼收糞法［2］;無菌雞、傳統(tǒng)雞收糞法;指示劑法同時收取肉雞回腸食糜、糞進行比較分析。對5周齡肉雞的研究表明，收糞法所得天冬氨酸、谷氨酸基礎內源損失顯著高于回腸食糜法，其余沒有顯著差異［4］。上述試驗只是采用了傳統(tǒng)方法間接研究了盲腸微生物對內源氨基酸損失的影響，所以本試驗擬從微生物遺傳標志分子16S rDNA、微生物關鍵代謝物氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等方面進一步探討盲腸微生物對內源氨基酸損失量的影響。因此，本試驗選用10日齡和31日齡雄性肉雞，飼喂無氮飼糧，旨在通過對回腸食糜法、收糞法所得的內源氨基酸基礎損失量進行比較研究，同時采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術分析盲腸微生物對收糞法測定內源氨基酸基礎損失量的影響，為肉雞飼料內源氨基酸基礎損失量的測定提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

分別選用10日齡和31日齡羅斯(Ross)308雄性肉雞120只和60只，均隨機分為常規(guī)飼糧組和無氮飼糧組，每組5個重復，其中10日齡時每個重復12只雞，31日齡時每個重復6只雞，正式試驗期均為4 d。試驗期常規(guī)飼糧組肉雞飼喂含有二氧化鈦指示劑的常規(guī)飼糧，無氮飼糧組肉雞飼喂含有二氧化鈦指示劑的無氮飼糧，添加量均為0.5%。非正式試驗期肉雞均飼喂不含指示劑的常規(guī)飼糧。肉雞除試驗期有特殊飼喂要求外，其余時間均自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。常規(guī)飼糧參照中國雞飼養(yǎng)標準(NY/T 33—2004)配制，無氮飼糧參照Adedokun等［1］推薦的配方配制，含指示劑的常規(guī)飼糧組成及營養(yǎng)水平、無氮飼糧組成分別見表1和表2。

表1 常規(guī)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of conventional diets(air－dry basis) %

1.2 樣品采集與制備

在10日齡和31日齡時，對肉雞進行饑餓處理，其中10日齡饑餓4 h，31日齡饑餓8 h，饑餓后稱重，剔除體重極大和極小的雞只，待試驗雞只體重排序后按照拉丁方原則，使得每個重復涵蓋體重從高到低的雞只，每個重復平均體重盡量一致。隨后開始正式試驗，無氮飼糧組肉雞飼喂含指示劑的無氮飼糧，常規(guī)飼糧組肉雞飼喂含指示劑的常規(guī)飼糧，共飼喂4 d。

在13日齡和34日齡時，肉雞糞便用鋪有尼龍紙的糞盤收集，收12 h，每隔2 h收1次，收集時將羽毛、飼料、皮屑等清除，收集后的糞便立即放入－20℃冰箱保存，12 h的糞便統(tǒng)一混勻后取部分凍干。室溫回潮24 h后，將糞便粉碎過60目分析篩，密封樣品，保存在－20℃冰箱待測。

表2 無氮飼糧組成Table 2 Compositon of the nitrogen－free diet %

在14日齡和35日齡時，肉雞先饑餓2 h，自由采食4 h后翅下靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉劑麻醉所有雞只，劑量為30 mg/kg體重，保證深度麻醉后立即屠宰，分離整段回腸。除去最后2(14日齡肉雞)或4 cm(35日齡肉雞)的回腸腸段再對折為2個部分，取后1/2段回腸食糜用于后續(xù)分析。將這部分腸段食糜用蒸餾水沖洗至鋁盒中。每個重復所有食糜混合成一個樣品。樣品收集好后，凍干。后續(xù)操作與上述糞便的方法一致。取出左右盲腸，將左側盲腸稱重，兩側盲腸液氮冷凍后保存在－80℃冰箱。測定時將每個重復的左右盲腸食糜混合為一個待測樣品，用于氨態(tài)氮濃度、VFA濃度、DGGE 譜帶圖分析［5］。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 盲腸食糜重量

將左側盲腸取出，稱重(W1);在超凈臺上解凍后，用手擠出全部食糜，之后再稱空盲腸重(W2)，兩者之差為盲腸食糜重量(△W=W1－W2)。

1.3.2 無氮飼糧水分測定

無氮飼糧水分測定參照國標GB/T 6435—2006。

1.3.3 樣品中二氧化鈦含量測定

樣品中二氧化鈦含量參照Short等［6］和鄧雪娟等［7］所述方法進行測定。

1.3.4 樣品中氨基酸含量測定

樣品中氨基酸含量用氨基酸自動分析儀進行測定，檢測單位為農業(yè)部飼料效價與安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，采用一般酸水解法，具體參照國標GB/T 18246—2000。

1.3.5 盲腸食糜氨態(tài)氮、VFA濃度測定

盲腸食糜氨態(tài)氮濃度測定采用Broderick等［8］所述方法，VFA濃度測定采用氣相色譜法，檢測單位為中國農業(yè)大學肉牛研究中心。樣品前處理:0.5 g盲腸食糜4℃解凍后，以W/V=1∶2比例用超純水稀釋，加入氧化鋯珠子0.1 g，渦旋分散混勻食糜，20 000×g 4℃離心20 min后取上清［9］。后續(xù)試驗步驟參照高?。?0］所述。

1.3.6 盲腸食糜16S rDNA V3高變區(qū)DGGE條帶譜比較

1.4 內源氨基酸基礎損失計算公式

內源氨基酸基礎損失的計算公式為:

式中:EAA表示內源氨基酸基礎損失;AA表示無氮飼糧飼喂肉雞的回腸食糜或糞中某氨基酸含量(mg/kg，凍干基礎);TDC1表示無氮飼糧中二氧化鈦含量(mg/kg，干物質基礎);TDC2表示無氮飼糧飼喂肉雞的回腸食糜或糞中二氧化鈦含量(mg/kg，凍干基礎)。

1.5 DGGE圖譜分析

利用Quantity One軟件進行條帶Match分析，超出膠圖全長2%的垂直距離差被視作不同條帶。允許2%距離差是考慮到同一板膠不同條帶可能會有遷移誤差。利用Quantity One軟件中Gauss Model Bands命令計算條帶灰度值，并用 Gauss Model Trace表示，單位為INT×mm。隨后依據具體情況選取組內共有且灰度值在所在泳道屬最亮的9～15條記錄灰度值，以所選條帶總灰度值作為分母，求所選條帶灰度值百分比，計算各飼糧所選條帶灰度值百分比的平均值。這樣處理主要考慮到光度計計量DNA濃度、PCR反應、DGGE操作等產生的誤差不適合不同樣品進行量的比較，所以條帶灰度值只在同一條泳道內進行比較，后轉化為條帶灰度值百分比這一相對量用于觀察差異條帶在所屬樣品中的豐度情況。

1.6 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件中獨立樣本T－test法進行顯著性分析。結果以平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 14日齡和35日齡肉雞回腸食糜與糞中內源氨基酸基礎損失量的比較

由表3可知，與回腸食糜法相比，收糞法所得的14日齡肉雞組氨酸內源基礎損失量沒有顯著變化(P＞0.05)，其余均極顯著升高(P＜0.01);收糞法所得的35日齡肉雞異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸內源基礎損失量沒有顯著變化(P＞0.05)，其余均顯著升高(P＜0.05);其中丙氨酸基礎損失量提高最多，在14日齡和35日齡均高達100%左右。

2.2 無氮飼糧對14日齡和35日齡肉雞盲腸食糜重、氨態(tài)氮和VFA濃度的影響

由表4可知，在14日齡時，與常規(guī)飼糧組相比，無氮飼糧組肉雞盲腸食糜重、氨態(tài)氮濃度沒有顯著變化(P＞0.05)，盲腸食糜內丁酸濃度極顯著降低(P＜0.01)，異丁酸、戊酸濃度顯著降低(P＜0.05)，丙酸濃度極顯著升高(P＜0.01)。在35日齡時，無氮飼糧組肉雞盲腸食糜重較常規(guī)飼糧組極顯著升高(P＜0.01)，氨態(tài)氮、乙酸、異丁酸、異戊酸和戊酸濃度均極顯著降低(P＜0.01)。

2.3 飼喂常規(guī)飼糧與無氮飼糧的14日齡和35日齡肉雞盲腸食糜微生物16S rDNA V3高變區(qū)DGGE圖譜條帶比較分析

由圖1和表5可知，在14日齡時，常規(guī)飼糧、無氮飼糧各自灰度值百分比最高的條帶存在差異，常規(guī)飼糧所特有的其余條帶灰度值百分比分別為8%、15%、12%、4%，無氮飼糧的分別為6%、9%、5%、10%。在35日齡時，常規(guī)飼糧所特有的條帶中灰度值百分比最高的為11%，其余為7%、7%、5%;無氮飼糧所特有的條帶中灰度值百分比最高的為12%，其余為10%、6%、11%。

3 討論

3.1 內源氨基酸基礎損失量測定的影響因素

內源氨基酸基礎損失量受動物飼糧類型、日齡和測定方法等因素的影響［1］。Adedokun等［13］及Golian等［17］研究表明，無氮飼糧法與酪蛋白梯度回歸法測得的內源氨基酸基礎損失量差異不顯著，他們認為無氮飼糧法是簡便可行的測定內源氨基酸基礎損失量的方法。Ravindran等［18］研究發(fā)現(xiàn)采用18%酪蛋白作為飼糧唯一蛋白質來源時，35日齡肉雞內源氨基酸損失量顯著高于14日齡。Adedokun等［13］采用無氮飼糧法對不同日齡內源氨基酸基礎損失量進行測定發(fā)現(xiàn)，21日齡與14日齡內源氨基酸基礎損失沒有顯著差異，但5日齡要顯著高于上述2個日齡。將本試驗結果與之前已有的無氮飼糧法同一日齡的數據進行比較發(fā)現(xiàn)，本試驗35日齡數據與Ravindran等［18］研究數據基本一致，14日齡數據與 Adedokun等［13］研究數據差異顯著(表6)，推測產生差異的原因可能與外源指示劑種類、基礎飼糧中是否添加抗生素、麻醉方式等有關。

表3 14日齡和35日齡肉雞回腸食糜法和收糞法基礎內源氨基酸基礎損失量比較Table 3 Comparison of ileal digesta－based and excreta－based endogenous amino acid basal losses of broilers aged 14 and 35 days g/kg DM intake

據Adedokun等［1］綜述可知，影響內源氨基酸基礎損失測定值的因素如下:黏蛋白周轉速度、飼糧蛋白質或氨基酸水平、飼糧纖維水平、飼糧植酸含量、指示劑種類、腸道健康、動物日齡和品種及測定方法。比較本試驗與Adedokun等［13］的試驗方案，其中所用肉雞品種(Ross 308)、測定方法(無氮飼糧法)、飼糧纖維水平(占整個飼糧的5%)、肉雞日齡(14日齡)是一致的;在指示劑方面，Adedokun等［13］采用三氧化二鉻，本試驗采用二氧化鈦，Selle等［14］通過對已有文獻比較發(fā)現(xiàn)，較三氧化二鉻，二氧化鈦及酸不溶灰分能更顯著地指示出飼糧中添加植酸酶后提高的氨基酸消化率，且Oberleas等［15］研究表明三氧化二鉻在食糜中分布不均;另外，本試驗中因需測定微生物指標，基礎飼糧中沒有添加任何抗生素，這可能會導致定植于腸道的微生物數量增多，黏膜層增厚，黏蛋白周轉速度增加;在麻醉方式方面，Moughan等［16］試驗中發(fā)現(xiàn)戊巴比妥鈉麻醉法一直要優(yōu)于二氧化碳麻醉法。

表4 無氮飼糧對14日齡和35日齡肉雞盲腸食糜重、氨態(tài)氮和VFA濃度的影響Table 4 Effects of the nitrogen－free diet on cecal digesta weight，ammoniacal nitrogen and VFA concentrations of broilers aged 14 and 35 days

圖1 飼喂常規(guī)飼糧與無氮飼糧的14日齡和35日齡肉雞盲腸食糜微生物16S rDNA V3高變區(qū)DGGE圖譜條帶Fig.1 DGGE bands of highly variable region V3 in microbial 16S rDNA from cecum of broilers fed with the conventional diet and the nitrogen－free diet at 14 and 35 days of age

表5 飼喂常規(guī)飼糧與無氮飼糧的14日齡和35日齡肉雞微生物16 S rDNA V3高變區(qū)DGGE主要條帶灰度值百分比及特異性標識Table 5 Specific identity and percentage of the main bands from DGGE of highly variable region V3 in microbial 16S rDNA from cecum of broilers fed the conventional diet and the nitrogen－free diet at 14 and 35 days of age

表6 不同試驗中回腸食糜法測定飼喂無氮飼糧的肉雞內源氨基酸基礎損失量比較Table 6 Comparision of ileal digesta－based endogenous amino acid basal losses of broilers fed the nitrogen－free diet in different experiments mg/kg DM intake

3.2 盲腸微生物對收糞法測定內源氨基酸基礎損失量的影響

本試驗結果表明，收糞法相對于回腸食糜法可極顯著地提高絕大多數氨基酸內源基礎損失，產生這一差異的原因可能是盲腸微生物有較強的蛋白質合成活動和較弱的蛋白質發(fā)酵活動。在家禽體內，尿酸逆流進入盲腸后可快速分解為尿素，進而轉化為氨態(tài)氮［19－20］。微生物可利用糖類代謝所產生的碳鏈骨架和氨態(tài)氮合成其所需的所有氨基酸和其他含氮化合物［21］。有研究者用肥育豬瘺管法直接向大腸中加入若干淀粉，結果表明，隨著微生物可利用能量的增多，大腸中微生物利用氨態(tài)氮和胺從頭合成微生物蛋白質活動增強［22］。本試驗結果表明，相對于常規(guī)飼糧組，無氮飼糧組14日齡肉雞氨態(tài)氮濃度沒有顯著變化，35日齡氨態(tài)氮濃度極顯著降低，但盲腸食糜重極顯著增加。同時，無氮飼糧的主要成分為葡萄糖、淀粉等易被微生物有效利用的能量底物，飼喂無氮飼糧，肉雞盲腸食糜主要成分應是葡萄糖、淀粉。因此推測，飼喂無氮飼糧，肉雞盲腸微生物有充足的能量碳水化合物和一定量的氨態(tài)氮進行蛋白質合成作用，可能使糞中氨基酸濃度增加。另有研究表明:谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸是從成年公雞排泄物中直接分離純化出的微生物細胞中含量最豐富的3種氨基酸［23］，摩爾百分比都在13%左右。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，在14日齡和35日齡時，收糞法中所得肉雞排泄物中谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸內源基礎損失量顯著或極顯著高于回腸食糜法，絕對量差值在所有氨基酸差值中屬于最大的幾個，與文獻［23］所述基本一致。這也表明飼喂肉雞無氮飼糧，糞中微生物蛋白質濃度可能高于回腸食糜。在14日齡和35日齡時，相對常規(guī)飼糧，無氮飼糧組肉雞盲腸食糜蛋白質發(fā)酵分解的標志性脂肪酸異丁酸、戊酸、異戊酸含量，至少有2種無論從濃度還是每只雞盲腸總量上都顯著降低，這表明無氮飼糧使得肉雞盲腸微生物發(fā)酵蛋白質生成異丁酸、戊酸、異戊酸的作用顯著減弱。普通 PCR、DGGE能將16S rDNA含量占某微生態(tài)環(huán)境整個微生物16S rDNA總量超過1%的微生物檢測出來［24］，各種微生物16S rDNA拷貝數雖然存在一定差異，但是極少會引起10倍數量級的差別［25］，因此可將能在DGGE膠上探測出來的條帶對應的微生物納為在某個微生態(tài)環(huán)境下數量占優(yōu)勢的優(yōu)勢菌群。本試驗中，在14日齡時，無氮飼糧組5條優(yōu)勢條帶區(qū)別于常規(guī)飼糧組，同時不具備常規(guī)飼糧組所擁有的5條優(yōu)勢條帶，這些差異條帶灰度值占常規(guī)飼糧組優(yōu)勢條帶總灰度值的59%，占無氮飼糧組優(yōu)勢條帶總灰度值的72%。在35日齡時，無氮飼糧組4條優(yōu)勢條帶區(qū)別于常規(guī)飼糧組，同時不具備常規(guī)飼糧組所擁有的4條優(yōu)勢條帶，這些差異條帶灰度值占常規(guī)飼糧組優(yōu)勢條帶總灰度值的30%，占無氮飼糧組優(yōu)勢條帶總灰度值的39%。因此，DGGE圖譜結果分析表明，飼喂4 d無氮飼糧能改變14日齡和35日齡肉雞原有的盲腸微生物優(yōu)勢菌群，且14日齡改變尤為明顯。綜上所述，相對于回腸食糜法，收糞法測得的內源氨基酸基礎損失量顯著升高的原因可能與肉雞采食4 d無氮飼糧后，盲腸原有微生物優(yōu)勢菌群發(fā)生改變，微生物蛋白質合成作用增強有關。但具體哪些微生物最終引起這一變化，還需要通過DGGE差異條帶回收克隆測序作進一步研究。

4 結論

相對于回腸食糜法，收糞法測得的大多數氨基酸內源基礎損失量顯著升高。肉雞采食4 d無氮飼糧后，盲腸原有微生物優(yōu)勢菌群發(fā)生改變。

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