丁洛陽(yáng) 蔡繆熒 王夢(mèng)芝 喻禮懷

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

過(guò)量的氧自由基可引起神經(jīng)元胞體的損傷，使腦內(nèi)總RNA和蛋白質(zhì)含量下降，神經(jīng)元密度降低，造成動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降及機(jī)體的衰老。而隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，抗氧化、抗衰老和亞健康狀態(tài)等越來(lái)越為人們所關(guān)注［1］。研究認(rèn)為，ω－3系列多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)具有清除自由基、提高超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性、降低過(guò)氧化脂質(zhì)水平、抗衰老等功能［2］。ω－6、ω－3 系列 PUFA 在機(jī)體的代謝過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)，其合理比例的攝入，對(duì)于機(jī)體抗氧化、抗應(yīng)激能力的提高及健康狀態(tài)的維持至關(guān)重要。但迄今為止，畜禽飼糧中 ω－6/ω－3 PUFA比例的合理范圍尚未確定，且關(guān)于其比例對(duì)擔(dān)負(fù)著代謝、解毒、抗氧化等功能的重要器官——肝臟的影響規(guī)律的研究尚不多見(jiàn)［3］。揚(yáng)州鵝是由揚(yáng)州大學(xué)、揚(yáng)州市農(nóng)林局以太湖鵝為母本選育而成，于2006年通過(guò)國(guó)家畜禽品種委員會(huì)審定的品種。目前對(duì)于該品種的研究主要涉及其生產(chǎn)性能及營(yíng)養(yǎng)需要等［4－6］，而關(guān)于 ω－6/ω－3 PUFA 比例對(duì)該品種肝臟抗氧化功能的影響尚無(wú)報(bào)道。本試驗(yàn)以揚(yáng)州鵝為研究對(duì)象，通過(guò)飼喂4個(gè)梯度的ω－6/ω－3 PUFA比例飼糧進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，研究其對(duì)肝臟過(guò)氧化脂質(zhì)和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在探討ω－6/ω－3 PUFA比例影響肝臟抗氧化功能的規(guī)律與機(jī)理，并為生產(chǎn)實(shí)踐中揚(yáng)州鵝的科學(xué)飼養(yǎng)和油脂飼料的合理使用提供理論參考，同時(shí)也為理想脂肪酸模式的研究提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從江蘇省高郵市揚(yáng)州鵝養(yǎng)殖基地選擇160只同批出雛、體質(zhì)健壯、體重(0.407±0.023)kg、飼養(yǎng)管理一致的21日齡揚(yáng)州鵝苗，隨機(jī)分成4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只，公母各占1/2。飼糧經(jīng)7 d過(guò)渡為試驗(yàn)飼糧，29日齡開(kāi)始正式試驗(yàn)。4組試驗(yàn)鵝分別飼喂 ω－6/ω－3 PUFA 比例為 12∶1、9∶1、6∶1、3∶1 的試驗(yàn)飼糧，參考我國(guó)研究者對(duì)揚(yáng)州鵝營(yíng)養(yǎng)的研究［4－6］及 NRC(1994)［7］標(biāo)準(zhǔn)配制飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 樣品采集與處理

試驗(yàn)鵝飼養(yǎng)至42、56和70日齡時(shí)，每組分別隨機(jī)取8只，空腹24 h進(jìn)行屠宰測(cè)定，5 min之內(nèi)快速完成屠宰、采血，迅速在冰盤(pán)上分離得到肝臟，即時(shí)進(jìn)行樣品處理和指標(biāo)測(cè)定。

組織勻漿:取肝臟組織用5%的生理鹽水勻漿，勻漿液在4℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

電鏡切片:迅速于肝最大葉距邊緣5 mm處切取肝組織，于25%的戊二醛固定液中預(yù)固定10 min，取出切成1 mm3見(jiàn)方的組織塊數(shù)塊，放入25%戊二醛中固定。24 h后更換1次固定液，而后送至揚(yáng)州大學(xué)電鏡中心制作電鏡超薄切片。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

在4℃條件下將勻漿液以10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋成1%后，以考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)試劑盒測(cè)定組織蛋白質(zhì)含量。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定。具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，測(cè)定所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

一氧化氮(NO)含量采用 Griess法［8］測(cè)定。將不同濃度的亞硝酸鈉磷酸鹽緩沖溶液40 μL，加入到160 μL的Griess試劑(0.1%萘乙二胺溶液與1%的磺胺5%磷酸溶液)中，混勻靜置20 min，550 nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液光密度(OD)值。以亞硝酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品40 μL進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 NO含量。

1.4 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

參照李翔［9］的試驗(yàn)方法進(jìn)行。樣品于2.5%戊二醛中固定2 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗2～20 min。0.1%鋨酸固定30～120 min，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗。再按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮(2次)各5 min梯度脫水。丙酮與環(huán)氧樹(shù)脂1∶1混合浸透2 h，純環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑浸透2 h包埋，80℃恒溫箱內(nèi)10 h聚合，超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞鉛雙重染色各10 min染色后，透射電鏡觀察，拍照記錄。在每例肝臟樣品的電鏡圖片中選取清晰圖片，每幅圖片中平均選取5個(gè)不重疊的視野，每個(gè)視野測(cè)定10個(gè)完整的線粒體面積，以其平均值作為該例線粒體的面積。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 16.0軟件的one－way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析和Tukey多重比較。P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ω-6/ω-3 PUFA比例對(duì)肝臟MDA、NO含量的影響

由圖1可知，揚(yáng)州鵝肝臟組織MDA的含量隨日齡的增加呈上升趨勢(shì)，以70日齡較高，升高的幅度以 12∶1 和9∶1 組較大，而 3∶1 和 6∶1 組較小。各組間的比較可見(jiàn)，在各個(gè)檢測(cè)日齡，揚(yáng)州鵝MDA含量都有隨ω－6/ω－3 PUFA比例的降低呈現(xiàn)下降的趨勢(shì);其中3∶1和6∶1組顯著低于其他2組(P ＜0.05)，但3∶1 和 6∶1 組之間及 9∶1 和 12∶1 組之間均差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 ω-6/ω-3 PUFA比例對(duì)肝臟MDA含量的影響Fig.1 Effects of ω－6/ω－3 PUFA ratio on liver MDA content

由圖 2可知，NO 含量隨 ω－6/ω－3 PUFA 比例的降低呈下降的趨勢(shì)，各日齡皆以3∶1組最低。其中42日齡時(shí)，3∶1和6∶1組顯著低于其他2組(P ＜0.05)，但3∶1 和 6∶1 組之間及 9∶1 和 12∶1 組之間均差異不顯著(P＞0.05)。56日齡時(shí)以12∶1組最高，顯著高于其他3組(P＜0.05)。70日齡時(shí)以12∶1組最高，顯著高于其他3組(P＜0.05);9∶1和6∶1組次之，這2組也顯著高于3∶1組(P＜0.05);但9∶1 和 6∶1 組間差異不顯著(P ＞0.05)。

2.2 ω-6/ω-3 PUFA比例對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可見(jiàn)，3∶1和6∶1組肝細(xì)胞胞核較圓且居中，核仁明顯;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原顆粒、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見(jiàn)，少見(jiàn)脂滴，線粒體數(shù)量較多，內(nèi)脊呈短管狀且排列規(guī)則。9∶1和12∶1組肝細(xì)胞胞核橢圓、扁圓或不規(guī)則，核膜內(nèi)溢溶解的較為嚴(yán)重，核仁不明顯;胞質(zhì)內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略見(jiàn)擴(kuò)張;線粒體可見(jiàn)明顯腫脹，嵴斷裂或消失且排列不規(guī)則;糖原顆粒及其他細(xì)胞器未見(jiàn)有異常的情況，但數(shù)量有所減少。由表2可見(jiàn)，各組肝細(xì)胞線粒體平均面積以 12∶1 組最大，其他次依次為 9∶1、6∶1、3∶1組，但差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 ω-6/ω-3 PUFA比例對(duì)肝臟NO含量的影響Fig.2 Effects of ω－6/ω－3 PUFA ratio on liver NO content

圖3 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The ultra－structure of liver cells

表2 肝細(xì)胞線粒體平均面積Table 2 The average area of mitochondria in liver cell μm2

3 討論

自由基是指在最外層軌道中含有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或特殊狀態(tài)的分子，即具有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)、分子或離子。機(jī)體在有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O－2·)，進(jìn)而產(chǎn)生羥基自由基，其極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力可使各種生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化，形成過(guò)氧化脂質(zhì)。進(jìn)而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)，DNA的雙旋交聯(lián)出現(xiàn)錯(cuò)誤或無(wú)法分裂，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、代謝。過(guò)量的氧自由基可損傷神經(jīng)元細(xì)胞，而減退動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力、促進(jìn)機(jī)體的衰老［10］。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一系列抗過(guò)氧化物酶，可清除過(guò)氧化脂質(zhì)而減輕氧化損傷［11］。脂質(zhì)中含有的不飽和脂肪酸與氧自由基有高度的親和性，因此，脂質(zhì)最易受自由基的氧化損傷而產(chǎn)生過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物 MDA［12－13］。MDA 具有細(xì)胞毒性，可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，炎癥介質(zhì)的釋放。龍建綱等［14］研究報(bào)道，MDA對(duì)線粒體呼吸、丙酮酸脫氫酶、α2酮戊二酸脫氫酶等具有顯著的抑制作用。NO與O－2·作用形成毒性較強(qiáng)的氧化亞硝酸根自由基，可使蛋白質(zhì)或酶失活，抑制呼吸鏈酶，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，引起組織氧化損傷［15］。因而，MDA與NO含量能反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映細(xì)胞膜系統(tǒng)損壞程度［16］。

研究表明，ω－3 PUFA不僅能直接清除自由基，還提高SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)等抗氧化酶的活性，從而有效地去除自由基和過(guò)氧化脂質(zhì)，起到保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損傷的作用［2］。本研究表明，鵝肝臟MDA、NO含量隨日齡的增加呈上升趨勢(shì)，并以70日齡的相對(duì)較高，這符合機(jī)體生長(zhǎng)的規(guī)律，與在健康和正常狀態(tài)下，隨年齡的增加機(jī)體自身的抗氧化能力逐漸下降并基本一致。各組間比較又發(fā)現(xiàn)，肝臟MDA、NO含量隨ω－6/ω－3 PUFA比例的降低呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。其中，3∶1和6∶1組極顯著低于其他2組，表明了飼糧ω－6/ω－3 PUFA比例較低時(shí)，可有效提高揚(yáng)州鵝肝細(xì)胞去除過(guò)氧化脂質(zhì)物的能力，改善細(xì)胞的抗氧化和抗衰老能力。

在某些因素影響下，自由基的生成過(guò)多，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，影響細(xì)胞膜的變形能力和流動(dòng)性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷［17］。本研究通過(guò)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)州鵝肝細(xì)胞的變化以膜系結(jié)構(gòu)(線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)為主，與郭曉英等［18］、莫志亞等［19］關(guān)于大鼠，何海健等［20］關(guān)于仔豬，龔濤等［21］關(guān)于雛雞的報(bào)道結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，飼糧ω－6/ω－3 PUFA比例較高組的揚(yáng)州鵝肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)糖原顆粒有所減少，線粒體膜系結(jié)構(gòu)變化較大。這可能是由于較高 ω－6/ω－3 PUFA比例組肝細(xì)胞去除自由基的酶活性下降，去除自由基過(guò)氧化能力減弱，而且胞質(zhì)中存留較高水平的NO與O－2·，進(jìn)而形成毒性較強(qiáng)的氧化亞硝酸根自由基，抑制呼吸鏈酶，破壞線粒體結(jié)構(gòu)所致;另外，還可能與其較高含量的過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA攻擊細(xì)胞生物膜系統(tǒng)，使之線粒體受損所致。

4 結(jié)論

飼糧 ω－6/ω－3 PUFA 比例較低的 3∶1 和6∶1 組能夠明顯降低生長(zhǎng)期揚(yáng)州鵝肝臟MDA、NO含量，減少肝細(xì)胞膜系結(jié)構(gòu)的損傷，改善其抗氧化狀態(tài)。

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