朱宇旌 潘香岑 張 勇* 李欣蔚 馬 勇 邵彩梅

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866;2.遼寧禾豐牧業(yè)有限公司，沈陽 110164)

紅三葉(red clover)又叫紅車軸草、紅荷蘭翹搖，為豆科三葉草屬多年生牧草。紅三葉草在我國栽培廣泛，總異黃酮含量豐富。紅三葉異黃酮(red clover isoflavones，RCI)作為異黃酮類植物雌激素，在結(jié)構(gòu)上與內(nèi)源雌激素相似，能夠與雌激素受體(ERs)、孕激素受體和雄激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮弱雌激素樣效應(yīng)［1－2］。目前，食品和飼料工業(yè)中應(yīng)用的異黃酮主要來自大豆，但紅三葉各個部位異黃酮含量均高于大豆，且全株都可利用，成本比大豆低廉［3］，因而其開發(fā)利用日益受到人們的重視。RCI已經(jīng)成為國內(nèi)外繼大豆異黃酮之后又一種研究較多的植物雌激素。

1 RCI的結(jié)構(gòu)特征

RCI屬于4’－甲氧基類異黃酮，需要在生物體內(nèi)通過微生物酶系作用轉(zhuǎn)化成具有雙羥基結(jié)構(gòu)以及活性更高的4’－羥基類異黃酮，從而更好地與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮植物雌激素作用［4］。目前紅三葉中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40多種異黃酮，可達干物質(zhì)含量的1.5%～2.5%，其中主要的4種雌激素為芒柄花素、鷹嘴豆芽素A(雞豆黃素A)、染料木素和大豆素(圖1［5］)，其含量是其他植物無法與之相比的。其中芒柄花素和鷹嘴豆芽素A含量尤為高，而且是大豆中不存在的異黃酮類化合物［6］，因此具有很高的開發(fā)價值。RCI在新鮮的植物體內(nèi)以糖苷的形式存在，在適宜的提取條件下發(fā)生水解或酶解，使大部分的糖苷轉(zhuǎn)化成苷元，而苷元才是其真正的有效成分。

2 RCI的提取、純化及鑒定

目前，RCI常用的幾種提取方法主要有乙醇浸提、加壓提取、堿水提取等。朱宇旌等［7］采用乙醇浸提法，結(jié)合超聲波輔助提取紅三葉中的總異黃酮，通過對提取劑乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比4因素3水平的正交試驗，得出RCI的最佳提取工藝條件為:預(yù)浸時間8 h，乙醇濃度70%，料液比1∶25，提取溫度70℃，提取時間1 h。在此條件下RCI的提取量為24.6 mg/g，粗提物得率為24.74%，粗提物純度為5.99%。采用乙醇作為浸提液安全無毒，且價格低廉，可回收利用。楊薇薇等［8］采用加壓提取工藝，當壓力為0.8 MPa，乙醇濃度為 50%，料液比為 1∶15，保壓時間為5 min時，紅三葉草總異黃酮得率為57.0 mg/g，質(zhì)量分數(shù)為8.85%。加壓提取工藝與醇提法相比，是一種快速高效的新方法，但國內(nèi)研究少見。吳三林等［9］采用堿水為浸提液，最佳提取工藝為:提取溫度80℃，提取時間1 h，料液比1∶12，堿水 pH 為11，提取2次，總異黃酮提取率0.70%。該方法的優(yōu)點是降低工藝成本，缺點是提取過程中有效成分可能被分解。

圖1 紅三葉異黃酮的結(jié)構(gòu)式及組成Fig.1 Structure and composition of red clover isoflavones［5］

朱宇旌等［10］進一步對所提取的RCI采用大孔吸附樹脂HPH 480進行了純化，該工藝不僅吸附量大，而且解吸率高，適合其分離富集。動態(tài)吸附試驗結(jié)果表明:RCI較好的動態(tài)吸附工藝參數(shù)為上樣液濃度0.8～1.3 mg/mL，上樣液pH為5，徑高比1∶20，流速2 mL/min，室溫下上樣，采用70%乙醇室溫洗脫，流速為1.0 mL/min，洗脫劑用量為4 BV，在此條件下得到的RCI純度為25%以上，較粗提物提高4倍以上。采用樹脂吸附法與溶劑萃取法聯(lián)用對RCI進行精制以乙酸乙酯萃取效果較好，可使RCI純度達到32.29%;采用樹脂吸附法與重結(jié)晶法聯(lián)用，純度可達44.78%，但重復性差。

常平等［11］采用高效液相色譜法對紅三葉草中4種主要異黃酮物質(zhì)含量進行了鑒定，得出紅三葉草中主要異黃酮物質(zhì)含量分別為大豆黃素0.43% ～0.60%、染料木素0.35% ～0.64%、芒柄花素4.79%～9.29%和鷹嘴豆芽素A 1.32%～2.63%。

3 RCI的生理功能

RCI是一類具有營養(yǎng)作用和治療意義的非固醇類物質(zhì)，是目前國際上公認的安全有效的天然植物雌激素。RCI不僅在醫(yī)學上具有提高機體免疫力、抗微生物、抑制炎癥［12］、抗氧化和抗自由基形成［13］、強心降血脂、預(yù)防高血壓［14］、控制焦慮癥［15］等作用，而且適量應(yīng)用于動物飼料還有促進動物生長、提高飼料利用率、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、促進生殖系統(tǒng)發(fā)育、提高泌乳和繁殖力等作用，并且具有劑量小、見效快、無毒副作用等優(yōu)點［16－17］。

3.1 RCI的雌激素與抗雌激素作用

RCI的4種主要成分均具有雌性激素作用，它們的特殊之處在于:1)幾乎能分布到機體的每個細胞中去發(fā)揮作用，這是機體自身分泌的激素所不能達到的。2)具有雙向調(diào)節(jié)作用，在機體內(nèi)源性雌激素水平較低時表現(xiàn)為雌激素激動劑的作用;而當體內(nèi)雌激素水平偏高時，它占據(jù)雌激素受體表現(xiàn)為抗雌激素作用。動物體內(nèi)雌激素的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)存在3條途徑:通過腦垂體產(chǎn)生的激素來調(diào)節(jié)雌激素的分泌;通過卵巢功能進行反饋性調(diào)節(jié);通過一些生長因子和細胞因子進行調(diào)節(jié)。腦垂體能生成黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵 泡 刺 激 素 (follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH)、催乳素(prolactin，PRL)和促性腺激素釋放激素(GnRH)等激素，其中LH對卵巢產(chǎn)生雄激素具有很強的刺激作用，成為內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的主要因素。

圖2－A顯示在繁殖期間，雌二醇的大量分泌會反饋給下丘腦，而后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放會引起GnRH以低頻的脈沖形式進行釋放。在下丘腦雙向調(diào)節(jié)雌激素釋放的過程中，α型雌激素是感受神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)的主要雌激素類型。當體內(nèi)雌激素水平分泌過高時，RCI可占據(jù)雌激素受體，使體內(nèi)分泌的過量的雌激素不能與受體結(jié)合，從而不能發(fā)揮作用。圖2－B顯示當雌激素分泌量減少時，同樣會反饋給下丘腦，此時下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放則會增加GnRH的釋放頻率。參與調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)同樣是調(diào)節(jié)心率和體溫的重要因子，因此這也是雌性激素減少以后會相應(yīng)引起潮熱和心率加快的原因。外源性添加RCI則可消除雌激素缺乏對下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)釋放的反饋調(diào)節(jié)，因此，RCI可以緩解女性雌激素分泌量減少引起的潮熱和心率加快癥狀。

圖2 下丘腦-垂體-卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控回路Fig.2 The neuroendocrine circuit of the hypothalamo － pituitary － ovarian axis［18］

3.2 RCI的抗腫瘤作用

RCI可以降低乳腺癌的發(fā)病率。目前認為RCI的防癌機理在于RCI能優(yōu)先與雌激素受體結(jié)合，抑制其循環(huán)轉(zhuǎn)換成雌二醇類固醇的前體酶，抑制細胞信號途徑的信號傳遞［19］。

腫瘤細胞的增殖受某些生長因子和雌二醇調(diào)控(圖3)［19］。生長因子信號通過膜受體激活磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3－K/AKT)和絲裂原活化蛋白激酶的激酶－細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(MEK/ERK1/2)等細胞信號途徑［20］。激活的雌二醇受體與這些信號途徑相互作用，這一過程可能涉及膜關(guān)聯(lián)雌二醇受體的參與［21－22］。相反，激酶信號途徑可能激活細胞內(nèi)的雌激素受體［23］。一些植物雌激素是細胞信號途徑中的抑制因子，或者是雌激素受體的弱配體，例如染料木黃酮是酪氨酸激酶的抑制蛋白，而芹黃素則是PI3－K信號途徑的抑制因子，因此植物雌激素可以抑制生長因子誘導的MEK/ERK1/2和PI3－K/AKT信號通路，抑制腫瘤的生長［24］。有研究表明，白藜蘆醇能抑制Src酪氨酸激酶，同時，通過雌激素受體α(ERα)依賴型機制調(diào)節(jié) PI3－K 信號途徑［25］。盡管需要高劑量的使用上述植物雌激素才能達到抑制細胞信號途徑的效果，但這些植物雌激素在調(diào)整癌細胞的生長方面可能會起到關(guān)鍵作用。

圖3 紅三葉異黃酮的抗腫瘤作用機制Fig.3 The antitumor mechanism of red clover isoflavones［19］

3.3 RCI的抗氧化作用

植物雌激素具有多個選擇性雌激素受體調(diào)控元件的活性，可與轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF－κB)相互作用，發(fā)揮抗氧化活性［26］。RCI的分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，因而具有抗氧化作用。RCI可作為自由基的供氫體，抑制自由基產(chǎn)生和消除自由基，保護機體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、染色體免受活性氧的攻擊，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生和阻斷脂質(zhì)過氧化物的鏈式反應(yīng)來發(fā)揮抗氧化作用。

天然抗氧化劑加強內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，以減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生中毒性疾病的危險［27］。消除自由基可以防御細胞免受其有害影響。多不飽和脂肪酸作為細胞膜的主要成分特別容易受到自由基的介導，因為其含有的共軛鍵結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)過氧化過程會導致細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂［28］。人體中的活性氧和自由基是引發(fā)衰老、癌變和細胞損傷的重要原因。RCI能保護DNA不被氧化破壞，有效消除DNA的氧化損傷。羥自由基、超氧自由基清除試驗及對豬油抗氧化試驗表明，RCI有較強的消除羥自由基、超氧陰離子自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，且隨添加量的增加，RCI抗氧化作用逐漸增強，當添加量達到4 mg/mL時，其抗氧化效果與0.02%的人工合成抗氧化劑2，6－二叔丁基對甲酚(BHT)相接近［29］。

3.4 潛在的抗病毒功能

大豆異黃酮中的染料木素可以抑制包膜或無包膜病毒，單鏈或雙鏈DNA或RNA病毒的感染，包括腺病毒的感染、單一皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和輪狀病毒，以減少它們動物的影響［30］。雖然RCI的抗病毒特性研究開展的不多，但因為RCI中主要成分也是染料木素，可以推測RCI具有抗病毒作用，但這還需要進一步研究證實。

3.5 RCI對雌激素受體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)

圖4顯示一旦雌激素受體形成二聚體且配體結(jié)合到E/F結(jié)構(gòu)域，雌激素受體即被活化，激素受體活化功能區(qū)1(AF－1)和活化功能區(qū)2(AF－2)就可以結(jié)合共調(diào)節(jié)因子?；罨拇萍に厥荏w既可以結(jié)合到DNA的雌激素效應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)上，也可結(jié)合到其他效應(yīng)元件上，諸如活化蛋白 1(AP－1)和 I型類固醇因子(SF－1)。AF－2的轉(zhuǎn)錄過程在 ERα和雌激素受體 β(ERβ)這2種受體中比較類似。AF－1的轉(zhuǎn)錄活性在ERβ中很低甚至可以忽略。

圖4 ERα和ERβ的結(jié)構(gòu)與激活Fig.4 The structure and the activation of estrogen receptors α and β［19］

ERα和ERβ在不同基因上編碼，類固醇受體的不同結(jié)構(gòu)域表明這2種受體存在一定程度的同源性，同時，這2種受體的DNA連接結(jié)構(gòu)域也具有高度的同源性，且配體連接E結(jié)構(gòu)域也有60%的同源［31］。因此，雌激素對于 ERα 和 ERβ，具有相似的親和力。由于這2種受體均具有2個活化功能區(qū)AF－1和AF－2，且這2個受體活化功能區(qū)一旦被激活，就可以結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，所以2種受體其C末端的AF－2的轉(zhuǎn)錄激活都依賴于配體結(jié)合。然而N末端AF－1的激活涉及到蛋白質(zhì)間的相互作用，故在不存在任何雌性激素配體的情況下依然能夠結(jié)合調(diào)節(jié)因子［32］。在此情況下，只有ERα可引起顯著的轉(zhuǎn)錄激活。所以AF－1和AF－2 對 ERα 的促轉(zhuǎn)錄活性遠大于 ERβ［33］。ERα的轉(zhuǎn)錄加強可阻斷細胞生長因子信號轉(zhuǎn)導通路，抑制癌細胞的生長［34］。RCI中的4種成分在機體中均可以發(fā)揮植物雌激素的作用，但RCI在機體內(nèi)對2種受體的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的機制還不清楚。

4 RCI對畜禽生長、免疫、繁殖和骨骼發(fā)育的影響

4.1 生長性能

RCI作為外源性弱的雌激素可與內(nèi)源性雌二醇競爭下丘腦、垂體雌二醇受體，干擾性激素的正常反饋調(diào)節(jié)機能，使內(nèi)源性激素水平提高或降低，進而使生長激素(GH)水平發(fā)生相應(yīng)變化。而GH又通過胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF－Ⅰ)的介導，促進組織的生長和發(fā)育。飼糧中添加4.38 mg/kg RCI時，雄性肉雞日增重提高了5.1%，料重比下降了9.2%，提高了飼料的利用率，說明RCI可能通過改變內(nèi)源激素水平從而間接促進公雞肌肉生長［35］。朱宇旌等［36］在肉雞飼糧中添加 20 mg/kg RCI時，肉雞整個生長階段表現(xiàn)的生長性能顯著優(yōu)于對照組，肉雞平均體增重提高6.86%。姜義寶等［37］也試驗證明在肉雞飼糧中添加20 mg/kg RCI時促生長效果較好，認為RCI可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)GH、IGF－Ⅰ、三甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)水平來影響肉雞的生長性能。但RCI對動物的生長具有雙向作用，添加量過多，生長性能反而呈現(xiàn)降低的趨勢。在肉雞飼糧中添加5～20 mg/kg RCI時，肉雞平均體增重隨添加劑量的增加而提高，當RCI添加量達到30 mg/kg時，肉雞的平均體增重、耗料量和料重比呈現(xiàn)下降的趨勢。因此，高劑量的RCI不僅不會促進動物生長，反而抑制其生長［37］。

4.2 免疫功能

RCI對動物免疫功能具有增強和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，對機體的細胞、體液及非特異性免疫功能有不同程度的影響。目前認為雌激素對免疫的調(diào)節(jié)作用是通過位于免疫器官或免疫細胞上的雌激素受體而發(fā)揮作用的。異黃酮直接作用于免疫器官(如胸腺)或各種免疫細胞上的雌激素受體，調(diào)節(jié)機體免疫功能，并且存在劑量效應(yīng)。

張勇等［38］試驗表明，適量的RCI提取物能夠促進免疫器官的發(fā)育，且對胸腺系數(shù)的影響呈劑量依賴效應(yīng);RCI促進小鼠非特異性免疫功能，較高劑量的RCI使小鼠血清溶血水平明顯上升，同時激發(fā)了小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。飼糧中添加RCI能顯著增加肉雞免疫器官法氏囊重，并顯著提高血清總蛋白和球蛋白含量。飼糧中添加20 mg/kg RCI顯著提高了產(chǎn)蛋后期母雞脾臟指數(shù)(較對照組提高了61.6%)［39］。在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，RCI具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用，在低劑量時表現(xiàn)出對生長免疫的促進作用，但高劑量時卻表現(xiàn)為抑制作用［40］。免疫抑制效應(yīng)在臨床上的意義表現(xiàn)在:一方面，免疫抑制對自身免疫性疾病有積極的影響;另一方面，在感染的防御過程中，RCI可減少有機體對免疫反應(yīng)產(chǎn)生的不利影響。從細胞生物學和動物試驗得出的證據(jù)表明，雌激素對免疫系統(tǒng)有重要的影響。人類疾病如自身免疫性類風濕關(guān)節(jié)炎，自身免疫性腎小球性腎炎，甚至惡性疾病如白血病均與雌激素分泌有關(guān)［18］。

4.3 繁殖性能

RCI對動物的生殖器官具有一定的影響。有研究表明攝入RCI的母羊，體內(nèi)各器官的異黃酮含量分布腎中最高，卵巢、子宮含量居中［5］，提示RCI對動物生殖性能有一定影響。紅三葉草中的提取物已被證明能抑制芳香酶活性，抑制炎癥發(fā)生［41］。動物研究表明，RCI影響機體的生殖發(fā)育，當給予高劑量的大豆素和染料木素，青春期大鼠在子宮有調(diào)節(jié)性激素受體基因的表達［42］。另外，RCI還可改善去卵巢大鼠的子宮萎縮狀況，發(fā)揮一定的雌激素作用［43］。

4.4 骨骼發(fā)育

RCI與動物的骨吸收及骨代謝密切相關(guān)。動物體內(nèi)雌激素的分泌隨著年齡的增長而降低，由于雌激素水平的下降，體內(nèi)骨代謝平衡破壞，使骨吸收大于骨形成，骨量逐漸減少，導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率增高。而RCI能夠與雌激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)［44］，可抑制骨吸收，減少骨丟失，有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。飼料中隨著RCI添加水平的提高，血清鈣含量呈升高趨勢，添加20 mg/kg RCI可顯著提高產(chǎn)蛋后期雞的脛骨灰分含量［37］。通過對去卵巢大鼠研究發(fā)現(xiàn)，RCI高劑量組的骨密度、骨礦物質(zhì)元素含量均顯著高于模型組，接近于雌激素組，低劑量組則沒有效果，說明RCI在一定劑量下可通過抑制破骨細胞的發(fā)育和分化，維持骨密度值處于相對穩(wěn)定的水平，增加其骨質(zhì)量，從而達到防治骨質(zhì)疏松癥的目的［45］。

5 小結(jié)

紅三葉草中主要含異黃酮的活性成分包括大豆黃素、染料木素、芒柄花素和鷹嘴豆芽素 A。RCI同時具有雌激素與抗雌激素作用，可調(diào)控雌激素受體轉(zhuǎn)錄，還具有體內(nèi)抗氧化作用。畜禽飼料中合理利用可提高其生產(chǎn)性能，改善畜禽健康水平，提高繁殖性能，促進骨骼發(fā)育。盡管RCI在畜禽生產(chǎn)中發(fā)揮作用的機理仍需進一步深入研究，但因其安全無毒、添加量少、效果顯著，在動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究中日益受到關(guān)注，是一種極具開發(fā)前景的新型綠色飼料添加劑。

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