劉麗莉 謝紅兵 楊永生 許丹寧 李江長 賀建華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128;2.湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湘潭 411201)

高溫應(yīng)激是影響夏季畜禽生產(chǎn)的重要因素，可造成畜禽生長和代謝紊亂、免疫力下降及肉品質(zhì)改變等，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。熱應(yīng)激反應(yīng)是動物機體通過動員自身防御機能克服應(yīng)激因子以避免組織器官損傷的一種非特異性防御反應(yīng)，若熱應(yīng)激作用時間過長、強度過大，機體會逐漸失去這一應(yīng)對能力，出現(xiàn)病理及衰竭狀態(tài)。因此，迫切需要對畜禽熱敏感、熱耐受性進行準確判斷和對熱應(yīng)激損傷的分子機制進行更全面系統(tǒng)的研究。目前，基因芯片技術(shù)已成功運用于生物分子標志物的篩選，并在全基因組內(nèi)同時分析待測樣本中成千上萬個基因的表達情況及其相互關(guān)系，篩選出一系列差異表達的候選基因，為尋找目標基因提供了一個強有力的手段［1］。熱應(yīng)激引起畜禽各階段的發(fā)生發(fā)展都與組織器官的多基因表達異常有關(guān)，基因芯片技術(shù)可以識別出動物熱應(yīng)激進程中基因表達的改變［2－3］，在大鼠、豬的熱應(yīng)激研究中，其基因的差異表達主要表現(xiàn)為熱休克蛋白、氧化還原基因、代謝相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、細胞凋亡基因、免疫基因的表達發(fā)生改變［3－4］。本文旨在就近年來基因芯片技術(shù)在篩選畜禽熱應(yīng)激差異表達基因的研究和應(yīng)用進行綜述，探討熱應(yīng)激動物生理過程中熱敏感基因的變化以及各基因間互作的動態(tài)效應(yīng)，為深入研究畜禽熱應(yīng)激損傷的分子營養(yǎng)調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 基因芯片技術(shù)的原理

基因芯片也稱為基因微陣列(cDNA microarray)或寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)，應(yīng)用已經(jīng)破解的全基因組已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子以及對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測分析(圖1)［2］。與傳統(tǒng)檢測RNA表達水平的技術(shù)相比，基因芯片可高敏感地定量、定性檢測差異基因表達水平，最大限度地達到同步、多靶點和高通量地研究成百上千個基因差異表達情況?；蛐酒褟V泛應(yīng)用于功能基因組研究、疾病分子診斷、突變檢測及藥物篩選等領(lǐng)域，在畜禽生產(chǎn)研究中發(fā)揮越來越大的作用。

畜禽熱應(yīng)激反應(yīng)機制是一個多步驟、多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，并不是一兩個或少數(shù)幾個基因所能決定的，利用基因芯片技術(shù)對動物熱應(yīng)激過程中的基因表達譜進行研究，成功發(fā)現(xiàn)了涉及動物生長代謝、炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)信號傳遞及生長、凋亡因子等上百條表達上調(diào)或下調(diào)基因［3，5］，篩選了與熱應(yīng)激損傷修復(fù)密切相關(guān)的基因，繼而開展了關(guān)鍵基因的功能研究，使該技術(shù)在探討畜禽熱應(yīng)激發(fā)生機制中產(chǎn)生了重要的應(yīng)用價值。

圖1 cDNA微陣列技術(shù)分析基因表達的原理Fig.1 The principle of gene expression analysis by cDNA microarray technology

2 基因芯片技術(shù)在熱應(yīng)激研究中的應(yīng)用

2.1 熱應(yīng)激引起畜禽器官氧化損傷相關(guān)的差異表達基因研究

2.1.1 腸道

熱應(yīng)激時，動物胃腸道血流量急劇減少，缺血缺氧產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)而造成腸道黏膜損傷，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［6］，而通過調(diào)節(jié)各種生長因子表達水平來促進隱窩細胞的分裂增殖，可使受損小腸上皮細胞得以修復(fù)［7－8］。Liu 等［7］將含有 23 937 條探針代表已知豬20 201個基因的Affmetrix GeneChip檢測熱應(yīng)激下豬空腸組織的基因表達譜，可知差異表達基因有143個，其中上調(diào)明顯的基因有趨化因子2(CXCL2)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)等68個，下調(diào)明顯的基因有表皮生長因子(EGF)、金屬硫蛋白(MT1A)、細胞色素P450家族(CYP2B22)等75個，基因本體論(GO)分類表明，熱應(yīng)激影響豬免疫、內(nèi)分泌、細胞損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達;Pathway分析表明，占1/3比例的差異基因信號通道與小腸上皮EGF介導(dǎo)的細胞再生、修復(fù)有關(guān)。熱應(yīng)激可誘導(dǎo)CXCL2上調(diào)，促進中性粒細胞的游走和趨化且吸引免疫細胞到達免疫應(yīng)答區(qū)，參與免疫調(diào)控和免疫病理反應(yīng)［9］，GST和 GPX2的上調(diào)催化還原型谷胱甘肽與親電子有害化合物的結(jié)合，并清除體內(nèi)沉積的各種內(nèi)生或外源性過氧化物而減緩機體熱應(yīng)激損傷［10］。

Yu等［4］利用基因芯片篩選到203個與豬小腸熱應(yīng)激相關(guān)的差異表達基因，包括熱休克蛋白(HSP)70、HSP90、HSP27等93個表達顯著上調(diào)和EGF、表皮生長因子受體(EGFR)等110個顯著下調(diào)基因，表達差異基因主要與熱休克、物質(zhì)代謝、抗氧化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、細胞分裂和增殖等有關(guān)。Lu等［11］通過基因芯片檢測熱應(yīng)激對大鼠小腸差異表達基因有422個，包括290個上調(diào)基因和132個下調(diào)基因，差異表達基因主要集中為熱休克蛋白家族(HSPs)超表達，如HSP27(HSPb1)、HSP70(HSPa1a、HSPa11、HSPa8)、HSP90(HSPcb)和HSP110(HSPh1)高表達以抵抗熱應(yīng)激的損傷，一些細胞因子參與抵抗炎癥并調(diào)節(jié)免疫功能。熱應(yīng)激狀態(tài)下HSPs表達量增多，多種蛋白質(zhì)與其形成復(fù)合體，通過其解離與結(jié)合來協(xié)助折疊新生蛋白質(zhì)，防止發(fā)生聚集現(xiàn)象;同時幫助變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和蛋白質(zhì)的線粒體跨膜移位，并經(jīng)由泛素－蛋白酶體通路清除嚴重受損蛋白質(zhì)等作用機制［12］，抵御熱應(yīng)激以維持機體正常的生命活動。

熱應(yīng)激導(dǎo)致腸道上皮細胞嚴重受損且明顯減退小腸屏障和吸收功能，Yu等［4］利用基因芯片并結(jié)合miRNA和mRNA的基因表達譜研究了熱應(yīng)激對大鼠空腸組織的差異基因表達，mRNA基因芯片分析發(fā)現(xiàn)382個差異表達基因，其中上調(diào)270個，下調(diào)122個，mRNA的差異表達分析主要從分子功能、生物進程、細胞組成和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝途徑進行分類;miRNA基因芯片發(fā)現(xiàn)29個差異表達基因，其中上調(diào)18個，下調(diào)11個，熱應(yīng)激誘導(dǎo)小腸上皮細胞損傷和凋亡，導(dǎo)致 miR－34a、miR－34b、miR－137等明顯上調(diào)。而 miR－34a、miR－34b 等 miRNAs作為凋亡基因(p53)的作用靶標可參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)、細胞周期阻滯、細胞凋亡等事件［13－14］，miR－34(包括 miR－34a、miR－34b 和 miR－34c)通過抑制多能性相關(guān)聯(lián)的基因從而阻止體細胞重編程［15］，大 鼠 局 部 缺 血 可 造 成 miR－137 表達上調(diào)［16］，組織損傷加劇使得 miR－137 表達顯著增加［17］。此外，通過生物信息學(xué)分析證明與熱應(yīng)激相關(guān)的mRNA表達變化與miRNA表達呈負相關(guān)［4］。

2.1.2 肝臟

Bhusari等［18］對熱應(yīng)激大鼠肝臟組織的基因芯片結(jié)果進行分析并確定了19個差異表達的靶標基因，其中包括乙醛脫氫酶2(ALDH2)、金屬硫蛋白1(MT－1)、ATP合酶 β 亞基(ATP5b)、蛋白酶體 β5(PSMB5)、酪蛋白激酶 2α(CSNK2a1)、細胞周期依賴激酶K4(CDK4)等12個涉及抗氧化通路和代謝相關(guān)的上調(diào)基因，及ATP合酶亞基8(ATP8)、過氧化氫酶(CAT)、細胞色素 P450(CYP2e1)等7個與活性氧自由基和線粒體表達相關(guān)的下調(diào)基因。ALDH2可通過在線粒體基質(zhì)內(nèi)清除 ROS 而起抗氧化作用［19］，MT－1 能有效清除羥自由基并螯合有毒重金屬［20］。熱應(yīng)激24～48 h可使CAT表達量呈現(xiàn)2倍峰值而后下降［21］，在小鼠中過表達人的CAT能顯著減少氧化損傷、DNA變異及H2O2等產(chǎn)物［22］。熱應(yīng)激發(fā)生時，HSP1可在熱誘導(dǎo)激酶的信號傳導(dǎo)下激活細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關(guān)的信號通路［23］，CSNK2a1能修復(fù)斷裂的染色體DNA鏈且阻止半胱天冬酶8(caspase－8)所誘導(dǎo)的細胞凋亡［24］，CDK4 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基(周期蛋白)組成，對細胞周期G1期的分裂增殖起到重要的調(diào)控作用，在抗氧化調(diào)控途徑中上調(diào)ALDH2、MT－1、CSNK2a1、CDK4 等基因而對熱應(yīng)激起抵抗作用，以減緩肝臟組織的應(yīng)激損傷［18］。

肝細胞微粒體中的CYP2e1參與異生物質(zhì)代謝，依賴NADPH通過電子傳遞途徑完成催化反應(yīng)。CYP2e1能通過NADPH氧化酶和異生代謝產(chǎn)物直接產(chǎn)生氧化應(yīng)激［25］，如果CYP2e1過表達，那么肝細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS將導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而促使肝細胞壞死，甚至凋亡。熱應(yīng)激可刺激CYP2e1產(chǎn)生ROS而引起肝臟毒性損傷，下調(diào)CYP2e1能調(diào)節(jié)小鼠適應(yīng)慢性熱應(yīng)激下的內(nèi)源ROS發(fā)生機制，啟動并上調(diào)CAT、ALDH2、SOD等抗氧化防御反應(yīng)系統(tǒng)［18］。PSMB5是26S蛋白酶體的重要組成部分，主要對細胞內(nèi)發(fā)生錯誤折疊、突變或非正常短期存在的蛋白質(zhì)進行修飾或降解，并直接參與氧化蛋白的降解和泛素－蛋白酶體通路［26］。PSMB5啟動子區(qū)域參與核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor 2，Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidantresponse elements，AREs)的結(jié)合，在一定程度上PSMB5表達水平可成為氧化應(yīng)激狀態(tài)的征兆，PSMB5表達上調(diào)則能有效清除熱應(yīng)激所造成的機體損傷性蛋白，以抵抗熱應(yīng)激來維持細胞的生命活力［18］。肝臟分解代謝過程中，高密度脂蛋白(HDL)通過干擾作用于內(nèi)皮細胞的促凋亡因子而起保護作用，HDL攜帶的脂蛋白和酶具有抗氧化的功能［27］。ATP5b是ATP合酶的β鏈，肝細胞膜上的一種載脂蛋白－I(APOA－I)的高親和力受體，這種受體在HDL的代謝機理和ATP的生物合成中起重要作用，APOA－I激活A(yù)TP5b受體從而介導(dǎo)HDL顆粒的胞吞作用，APOA－I和這一受體的結(jié)合嚴格依賴于 ADP的產(chǎn)生［28］，上調(diào) ATP5b為增強HDL的胞吞作用提供動力。

2.2 熱應(yīng)激影響畜禽生產(chǎn)性能相關(guān)的差異表達基因研究

2.2.1 肉品質(zhì)

通過基因芯片分析熱應(yīng)激下肉雞胸肌的差異表達基因有110個，其中包括F－框蛋白家族成員(FBXO11)、泛素B/C(UBB/UBC)、多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1(PABPC1)、乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)乙酰酶2(ACAT2)、長鏈脂肪酸延長酶2(ELOVL2)等67個上調(diào)基因，肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)、LEPROT等43個下調(diào)基因，差異表達基因主要與細胞結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)代謝和修飾等相關(guān)［5］。FBXO11在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解過程中具有對底物識別的特性［29］，泛素可指導(dǎo)蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)吞并作為胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸體的組成部分［30］，泛素－蛋白酶體蛋白質(zhì)水解途徑可能對肌肉蛋白質(zhì)的合成和肉的嫩度存在影響，當動物遭受嚴重應(yīng)激時，肌肉蛋白質(zhì)降解以提供肝、腎糖異生原料而導(dǎo)致肌肉萎縮，此時，骨骼肌組織中泛素－蛋白酶體通路表達上調(diào)以降解大量骨骼肌蛋白［31］。熱應(yīng)激條件下，與泛素相關(guān)的基因，如UBB/UBC、PABPC1、FBXO11，均出現(xiàn)表達量增加［32］，同時 Kuskwaha等［33］也進一步證實了泛素－蛋白酶體通路參與熱應(yīng)激的調(diào)控。ACAT2是參于脂肪酸降解代謝的酶，ACAT表達上升，表明肝臟利用脂肪酸的能力加大，導(dǎo)致脂肪酸氧化代謝增強。ELOVL2編碼延長酶且參與長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成，調(diào)控動物體內(nèi)的脂肪構(gòu)成或脂肪沉積［34］。瘦素(leptin，LP)是由脂肪細胞合成的基因產(chǎn)物［35］，并通過抑制神經(jīng)多肽mRNA的表達及分泌而影響采食量、導(dǎo)致體重下降［36］，使下丘腦弓狀核中的LEPROT發(fā)生沉默并調(diào)動LP受體信號通路來控制采食量［37］，熱應(yīng)激也直接影響到了牛外周血中瘦素基因的合成，并降低LP受體及其異構(gòu)型受體基因mRNA的表達［38］。PFKM 是糖酵解途徑中重要的調(diào)控因子，熱應(yīng)激引起PFKM的下調(diào)導(dǎo)致肌肉攝取葡萄糖減少致使糖酵解降低［39］，直接影響肌肉中氨基酸、脂質(zhì)含量及脂肪酸的組成。

2.2.2 繁殖性能

熱應(yīng)激損傷牛、羊、豬精子DNA的完整性，導(dǎo)致受精率明顯下降［40］，嚴重影響動物繁殖力甚至致使不育是可遺傳的［41］。對熱應(yīng)激下的雄性小鼠睪丸組織進行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)225個差異表達基因，其中包括分子伴侶鈣連接蛋白(CANX)、HSPcb1、T－復(fù)合多肽(TCP1)和催化反應(yīng)物FK506連接蛋白6(FKPB6)、蛋白酶體亞基(PSMA7)、異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)的差異表達，并在其子1、2代雄性小鼠睪丸組織中檢測到CANX、HSPcb1、TCP1的表達，其中 HSPcb1在子代穩(wěn)定地表達［40］。CANX過表達能糾正錯誤折疊蛋白質(zhì)并延緩細胞凋亡，對潛在的凋亡過程起抑制作用［42］;TCP1是一種復(fù)合蛋白質(zhì)，在精子發(fā)生過程中其基因表達量增加［43］;HSPcb屬于HSP90家族成員，是一種惰性、不穩(wěn)定的細胞基質(zhì)蛋白質(zhì)，上調(diào)HSPcb可以阻止錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的組裝，HSP90的表達水平可直接影響精子的發(fā)生甚至不育［41］。Li等［44］利用基因芯片對高溫處理8 h后的C57BL/6小鼠與耐熱應(yīng)激AKR/N小鼠睪丸組織的基因轉(zhuǎn)錄本表達分析，發(fā)生顯著上調(diào)的9個與熱休克蛋白相關(guān)以及4個與類固醇生物合成相關(guān)的差異表達基因，精子發(fā)生過程中HSPs分子伴侶的高度表達直接參與調(diào)控精母細胞減數(shù)分裂粗線期至精子形成［45］。此外，熱應(yīng)激可引起一系列與生殖性能相關(guān)基因差異表達的變化，明顯上調(diào)的基因有類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(CYPLLAL)等，明顯下調(diào)的基因有精子頂體相關(guān)蛋白3(SPACA3)、精細胞核周期RNA結(jié)合蛋白(STRBP)等［44］。

2.3 熱應(yīng)激影響體外細胞生長、凋亡相關(guān)的差異表達基因研究

急性熱應(yīng)激可使體外培養(yǎng)下的細胞周期停滯在 G1/S、G2/M 期［46－47］，并誘發(fā)細胞凋亡。利用表達譜基因芯片研究體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞在熱應(yīng)激前后的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)處理2 h后上調(diào)的基因主要與熱應(yīng)答、DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)修復(fù)有關(guān)，下調(diào)的基因主要與細胞循環(huán)、代謝和結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān);應(yīng)激8 h后HSP70下降到基礎(chǔ)水平，熱耐受能力消失，與凋亡相關(guān)基因開始上調(diào)表達［48］，與Soto等［49］的報道相似，40℃高溫應(yīng)激可使凋亡基因(Bax)表達顯著上調(diào)，B細胞淋巴瘤2(Bcl－2)表達顯著下調(diào)。Bcl－2主要生物學(xué)功能是增加細胞對多種凋亡刺激因素的抵抗力來減少細胞凋亡，Bcl－2 和 Bax 的表達失衡會改變細胞中 Bcl－2/Bax異二聚體形成，產(chǎn)生 Bcl－2/Bcl－2 或 Bax/Bax 同二聚體，后者增多則會引起細胞線粒體通透性增加，引起線粒體蛋白細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，激活caspase－9，從 而 導(dǎo) 致 細 胞 凋 亡。p53 是 Bcl－2 和Bax的上游調(diào)節(jié)基因，許多凋亡基因啟動子都存在p53 反應(yīng)元件(p53 responsive element，pRE)，結(jié)合p53后被激活轉(zhuǎn)錄表達，如腫瘤壞死因子(TNF)受體家族Bax、脂肪酸合酶(Fas)及其配體(Fasl)等表達增加，Bcl－2表達受抑制。p53還能促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放 TNF－α和 Fas，也能與 DNA復(fù)制蛋白 A(replication protein A，RPA)結(jié)合，阻止 DNA 復(fù)制，最終激活 caspase－7、6、3，促進細胞凋亡［50］。在熱應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶的活化可能依賴于胞內(nèi)鈣離子介導(dǎo)Bax升高而增加線粒體膜通透性，促進鈣離子外流調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生［51］。熱應(yīng)激嚴重影響小鼠腸上皮細胞系－6(IEC－6)的培養(yǎng)，引起一些生長因子的差異表達，如上調(diào)基因有轉(zhuǎn)分化生長因子(GDF)、血小板生長因子(PDGFA)、生長抑制因子(OK138)、血管生長因子(VEGFA)等，下調(diào)基因有白蛋白(ALB)、EGFR、成纖維細胞生長因子(FGF)等［3］，而生長因子通過與細胞膜上相應(yīng)配體結(jié)合，激活受體，使受體的酪氨酸激酶活性上升，催化細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)底物的酪氨酸殘基磷酸化，繼而促進DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的生物合成，加速細胞的增殖和分化［52］。

3 小結(jié)

基因芯片技術(shù)是對基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，在畜禽生產(chǎn)中進行多種差異基因表達譜的研究起重要作用。通過基因芯片技術(shù)篩選畜禽熱應(yīng)激差異表達基因，可以給出熱應(yīng)激的分子表達譜與非熱應(yīng)激以及應(yīng)激損傷修復(fù)之間的差異基因，從而識別出熱敏感的特異性基因及熱損傷的特異性基因，有助于揭示熱應(yīng)激發(fā)生與進展的分子機制;可以識別熱應(yīng)激損傷特異性和修復(fù)特征相關(guān)的分子標志物，有助于開展利用熱應(yīng)激分子特征進行緩解應(yīng)激損傷修復(fù)的研究，進一步調(diào)控差異表達基因來應(yīng)對熱應(yīng)激對畜禽機體損傷，并顯示出巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。此外，基因芯片技術(shù)能篩選出多條與熱應(yīng)激相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可通過調(diào)控異常表達基因的水平來深入研究與之相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，這對畜禽生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究都是非常重要的。

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