葉蘇娟 楊蔚菡 王宇 歐文婧 馬清平 朱文

肺癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。常規(guī)的放化療和手術(shù)治療是肺癌的基本治療方法，但大部分患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常規(guī)治療手段很難取得較好的臨床治療效果。因此，尋找新的治療方法非常重要。而肺癌是一個(gè)多基因異常導(dǎo)致的疾病。目前基因治療已被認(rèn)為是一種極具前景的腫瘤治療方法。

一氧化氮（nitric oxide, NO）作為一種多功能的小分子物質(zhì)和人體內(nèi)重要的信號(hào)傳遞因子之一，是目前國(guó)內(nèi)外腫瘤領(lǐng)域最新研究熱點(diǎn)[1,2]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）是內(nèi)源性NO合成的關(guān)鍵酶[3]。iNOS基因在生理狀態(tài)下不表達(dá)或僅少量表達(dá)，而在細(xì)胞因子等刺激下誘導(dǎo)型表達(dá)并產(chǎn)生高水平NO[4]。在腫瘤研究[5-12]中，高濃度的NO可通過(guò)細(xì)胞毒作用減緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、促進(jìn)分化和凋亡而起到一種抗腫瘤效應(yīng)。因此，倘若能通過(guò)提供NO供體藥物或基因轉(zhuǎn)染的方法增加iNOS基因的表達(dá)并誘導(dǎo)生成高濃度的NO對(duì)惡性腫瘤治療來(lái)說(shuō)將是一個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)[13]。目前有研究[14-20]報(bào)道，將iNOS基因轉(zhuǎn)染到乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、甲狀腺瘤等腫瘤后均表現(xiàn)出一種強(qiáng)烈的抗腫瘤效應(yīng)。然而，至今關(guān)于iNOS基因在肺癌中的基因治療還沒(méi)有研究報(bào)道。關(guān)于iNOS基因在肺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平，研究[5,21,22]報(bào)道其總體趨于一種中等量表達(dá)的關(guān)系，產(chǎn)生的低濃度NO可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高水平的NOS是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的一個(gè)有利的因素。因此，通過(guò)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞iNOS基因表達(dá)從而激發(fā)肺癌細(xì)胞釋放大量NO可能是抗肺癌治療的一個(gè)新的方法。

本研究擬構(gòu)建pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒載體，初步探討轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后iNOS在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化及誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡及抑制細(xì)胞增殖和遷移的作用。本研究將為肺癌基因治療奠定基礎(chǔ)，是臨床肺癌基因治療的一個(gè)新的探索。

1 材料和方法

1.1 材料 人iNOS質(zhì)粒iNOS-pCR4-TOPO購(gòu)自美國(guó)Open Biosystems公司。真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。大腸桿菌JM109購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，由本實(shí)驗(yàn)保種。四氫生物蝶呤（BH4）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。T4 DNA連接酶、HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；PCR Kit、膠回收試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Hoechst 3235購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Anti-iNOS購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PVDF膜（0.22 μm）購(gòu)自Millipore公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?孔板購(gòu)自美國(guó)Coster公司。

1.2 方法

1.2.1 pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)將購(gòu)買的iNOS-pCR4-TOPO菌株直接進(jìn)行劃平板、次日挑取單克隆并進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)的菌液進(jìn)行小量質(zhì)粒提取。然后以iNOS-pCR4-TOPO質(zhì)粒為模板，采用RTPCR的方法，擴(kuò)增iNOS基因的編碼區(qū)序列并重新連接到pVAX載體上，構(gòu)建含卡那霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-iNOS。以iNOS在GenBank中的序列BC130283.1為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物：5'-CGATGGAAAGCTTGCTGTAGAGATGGCCTGTCCTT GGAAATTTCTGT-3'（酶切位點(diǎn)HindIII）；下游引物：5'-GACGAGGTCTAGATGCCGGCAGCTTTAACCCCTCC TGTAG-3'（酶切位點(diǎn)XbaI）。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3,528 bp。高保真PCR反應(yīng)體系按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為：94oC變性2 min后進(jìn)入25個(gè)PCR循環(huán)（94oC、30 s，62oC、30 s，72oC、3.5 min），72oC、10 min，4oC保存。擴(kuò)增全長(zhǎng)iNOS基因序列后，1%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物，載體和PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI酶切純化后，將iNOS定向插入pVAX的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞以卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切鑒定正確的克隆由上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作。本實(shí)驗(yàn)均分3組：空白組、pVAX組和pVAX-iNOS組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種于6孔板或96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%時(shí)，將pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒分別與Lipofectamine 2000在室溫下共同孵育20 min后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。次日給予1×10-5mol/L BH4[16]（下述所有實(shí)驗(yàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染次日均給予相同濃度BH4處理）。轉(zhuǎn)染48 h后分別收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)iNOS在mRNA水平的表達(dá) 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后收取細(xì)胞用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR參閱試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)iNOS檢測(cè)引物序列：上游引物：5'-CCTGAGCTCTTCGAAATCCCACCTGAC-3'，下游引物：5'-AAACTATGGAGCACAGCAATG-3'，PCR產(chǎn)物332 bp。反應(yīng)條件：94oC變性5 min后進(jìn)入30個(gè)PCR循環(huán)（94oC、30 s，58oC、45 s，72oC、45 s），4oC保存。β-actin：上游引物：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCT TG-3'，下游引物：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT G-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：135 bp。反應(yīng)條件：94oC變性3 min后進(jìn)入35個(gè)PCR循環(huán)（94oC、30 s，57.4oC、45 s，72oC、1 min），4oC保存。1%瓊脂糖電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 Western blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)水平 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后收取細(xì)胞制備蛋白樣品，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。將等質(zhì)量的蛋白進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)PVDF膜，電壓為86 V，時(shí)間90 min。5%脫脂奶粉4oC封閉2 h，TBST洗膜后，分別加一抗（兔抗人iNOS單抗和鼠抗人β-actin多抗，均為1:500），4oC孵育過(guò)夜， TBST洗膜3次；加 HRP標(biāo)記二抗（兔抗鼠 IgG 1:5,000）， 37oC孵育1 h，TBST洗膜3次，等量的ECL反應(yīng)液A和B混合后加至膜上，顯影。

1.2.5 pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液（5 mg/mL PBS配制）20 μL/孔，37oC 5%CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，棄上清加入150 μL DMSO室溫振蕩混勻后測(cè)A490吸光值。每個(gè)濃度梯度做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后加入5 mL新鮮配制的卡諾氏固定液（甲醇:冰乙酸=1:3，現(xiàn)用現(xiàn)配），靜置10 min-15 min，棄去固定液，再加入卡諾氏固定液，靜置10 min-15 min，重復(fù)1次。棄去固定液后于空氣中干燥5 min。加入1 mL 0.5 μg/mL的Hoechst 3235避光染色30 min，PBS清洗2次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)（是否有凋亡小體形成）。

1.2.7 pVAX-iNOS真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 在6孔板中以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。24 h后，在各組單層細(xì)胞中間劃出一道裸露無(wú)細(xì)胞帶，PBS洗滌3次后加入1%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。劃痕0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，取寬度相等的位置觀察細(xì)胞遷移的情況，于倒置顯微鏡下觀察照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以Mean±SD表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-iNOS的構(gòu)建、鑒定和測(cè)序以iNOS-pCR4-TOPO為模板，通過(guò)高保真RT-PCR擴(kuò)增iNOS目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，iNOS片段大小正確（大小為3,528 bp）。將該iNOS PCR產(chǎn)物片段和pVAX載體直接進(jìn)行HindIII和XbaI雙酶切。iNOS經(jīng)HindIII和XbaI酶切后約為3,512 bp。pVAX載體經(jīng)HindIII和XbaI酶切后由環(huán)狀結(jié)構(gòu)（大小為3,000 bp）變?yōu)?,920 bp的單鏈結(jié)構(gòu)。然后將兩酶切產(chǎn)物純化后經(jīng)T4連接酶進(jìn)行連接，最后得到真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-iNOS（大小為6,432 bp）。經(jīng)初步電泳篩選正確后，將構(gòu)建的pVAX-iNOS質(zhì)粒載體進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，iNOS片段大小約為3,528 bp；雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，pVAX-iNOS質(zhì)粒載體經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切后得到3,512 bp和2,920 bp左右兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-iNOS構(gòu)建成功。

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中iNOS的表達(dá)檢測(cè) 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-iNOS質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后分別提取各處理組A549細(xì)胞的細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示iNOS轉(zhuǎn)染后在A549細(xì)胞中表達(dá)升高（條帶大小為332 bp）；相同轉(zhuǎn)染方法處理A549細(xì)胞48 h后收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示iNOS在轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS后的A549細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，相對(duì)分子質(zhì)量約為135 kDa，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-iNOS分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，通過(guò)MTT法對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)活力為89.83%，而轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)活力明顯受到抑制，達(dá)到約58.33%，而72 h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)活力約為47.88%（圖3，P＜0.01）?？梢钥闯?，基因轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)變化相對(duì)最為明顯。

圖1 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-iNOS的構(gòu)建。A：質(zhì)粒pVAX-iNOS的構(gòu)建。M：Marker（DL2000）； 1：iNOS PCR產(chǎn)物；2：iNOS PCR產(chǎn)物被HindIII和XbaI進(jìn)行切割并純化；3：載體pVAX被HindIII和XbaI進(jìn)行切割并純化；4：陽(yáng)性克隆的PCR鑒定；5：陽(yáng)性克隆的雙酶切鑒定；B：陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定（因序列過(guò)長(zhǎng)，此處只顯示以起始碼開始的部分測(cè)序結(jié)果）。Fig 1 Construction of eukaryotic expression plasmid pVAX-iNOS. A：Construction of pVAX-iNOS plasmid.M: Marker (DL2000); 1: PCR products of iNOS; 2: The digested and purified PCR products; 3: The digested and purified pVAX; 4: The positive clones confirmed by PCR; 5: The positive clones confirmed by double restriction enzyme digestion; B: Sequencing analysis of the positive clones (part of the sequence).

圖2 RT-PCR和Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS 48 h后iNOS基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平及其灰度值分析（**P＜0.01）。A：RT-PCR檢測(cè)空白組、pVAX和pVAX-iNOS轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中iNOS的mRNA表達(dá)水平及灰度值分析；B：Western blot檢測(cè)空白組、pVAX和pVAX-iNOS轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中iNOS的蛋白表達(dá)水平及灰度值分析。Fig 2 The mRNA and protein expression levels of iNOS in A549 cells transfected with pVAX-iNOS for 48 h by RT-PCR and Western blot analysis (**P＜0.01). A:The mRNA expression level of iNOS in A549 cells with different treatments by RT-PCR analysis; B: The protein expression level of iNOS in A549 cells with different treatments by Western blot analysis.

圖3 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS基因?qū)549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（**P＜0.01）Fig 3 Inhibition of cell proliferation of A549 cells after transfection of pVAX-iNOS for 24 h, 48 h and 72 h by MTT assay (**P＜0.01)

圖4 Hoechest 3235染色檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS 48 h后的細(xì)胞凋亡形態(tài)Fig 4 Induction of apoptosis of A549 cells transfected with pVAX-iNOS for 48 h by staining with Hoechst 3235

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pVAX-iNOS轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響Fig 5 Effect of the enhanced expression of iNOS on the migration ability of A549 cells transfected with pVAX-iNOS by a scratch assay

2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 將pVAX-iNOS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染和僅轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。Hoechst 3235染色后，經(jīng)電子熒光顯微鏡下觀察可見，經(jīng)pVAX-iNOS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，核出現(xiàn)固縮裂解為碎塊，產(chǎn)生明顯的凋亡小體（圖4）；轉(zhuǎn)染了空載體或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，幾乎看不見凋亡小體。該結(jié)果表明pVAX-iNOS質(zhì)粒在體外具有明顯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用。

2.5 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-iNOS轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和僅轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，在各組單層細(xì)胞中間劃出一道裸露無(wú)細(xì)胞帶，取寬度相等的位置觀察細(xì)胞遷移的情況。0 h時(shí)現(xiàn)各組細(xì)胞劃痕邊緣整齊，6 h、12 h和24 h后各組劃痕邊緣變得稍模糊，空白組及pVAX組的細(xì)胞向裸露的中間區(qū)域遷移，pVAX-iNOS組的細(xì)胞劃痕邊緣雖有模糊，但未見有細(xì)胞脫離，考慮為轉(zhuǎn)染導(dǎo)致部分細(xì)胞壞死或凋亡所致。36 h后空白組及pVAX組的細(xì)胞繼續(xù)向中間區(qū)域生長(zhǎng)，48 h后可明顯觀察到空白組及pVAX組的劃痕區(qū)域變窄，而pVAX-iNOS僅有少部分細(xì)胞向中間遷移生長(zhǎng)，劃痕區(qū)域清晰可見（圖5）。該結(jié)果表明pVAX-iNOS質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549具有明顯抑制細(xì)胞發(fā)生遷移的作用。

3 討論

肺癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與多種基因的異常表達(dá)及相互作用密切相關(guān)。基因治療已被認(rèn)為是一種極具前景的腫瘤治療方法。近年來(lái)，NO的雙重生物學(xué)效應(yīng)在腫瘤研究中得到了普遍重視，一方面，腫瘤細(xì)胞iNOS持續(xù)產(chǎn)生合適濃度NO可作為重要的信使分子，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，增加腫瘤血供和血管形成，促進(jìn)腫瘤增殖；另一方面，高濃度的NO對(duì)細(xì)胞又是一種損害，可通過(guò)細(xì)胞毒作用減緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑制血管生成、促進(jìn)分化和凋亡而起到抗腫瘤效應(yīng)[5-8]，同時(shí)，研究[7-12]表明，高表達(dá)iNOS可抑制肝癌、惡性黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤的致瘤性和轉(zhuǎn)移特性，并且還可提高結(jié)直腸癌[23]、卵巢癌[24]和非小細(xì)胞肺癌[21]等患者的存活率。因此，通過(guò)激發(fā)腫瘤細(xì)胞釋放大量的NO可能是抗腫瘤治療的一個(gè)新的方法[13]。

外源性誘導(dǎo)iNOS基因表達(dá)的方法包括NO供體藥物、細(xì)胞因子和功能性iNOS基因的轉(zhuǎn)染，但全身高濃度給予NO供體藥物容易導(dǎo)致低血壓的發(fā)生，細(xì)胞因子刺激法和NO供體法存在耐藥性差、副反應(yīng)大、特異性不強(qiáng)、毒性大等缺點(diǎn)，因此臨床上應(yīng)用存在一定困難[18,25]，而iNOS基因轉(zhuǎn)染可基本避免細(xì)胞因子刺激法和NO供體法的缺陷，目前已經(jīng)在乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、甲狀腺瘤等腫瘤中對(duì)iNOS轉(zhuǎn)基因后產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了研究[14-20]。

Soler等[14]首次報(bào)道在甲狀腺瘤模型中，iNOS可作為一個(gè)自殺基因進(jìn)行治療，并表現(xiàn)出一種強(qiáng)烈的抗腫瘤效應(yīng)。盡管質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比較低，由于NO的彌散可導(dǎo)致強(qiáng)烈的旁觀者效應(yīng)，iNOS基因的抗腫瘤效應(yīng)非常明顯，且iNOS基因在腫瘤中可被可靠地定向到腫瘤細(xì)胞而避免產(chǎn)生全身毒性作用。同樣，在黑色素瘤和腎癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的旁觀者效應(yīng)[15]。Jenkins等[26]將iNOS基因轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞后，持續(xù)分泌大量NO，并可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。Xie等[27]對(duì)荷瘤小鼠（K-1753細(xì)胞）給予iNOS基因治療后，腫瘤出現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)抑制；體外實(shí)驗(yàn)也同樣證實(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)染iNOS基因可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生溶解和誘導(dǎo)旁細(xì)胞發(fā)生凋亡。Worthington等[20]通過(guò)使用輻射誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（野生型激活片段1，WAF1）和陽(yáng)離子脂質(zhì)體將iNOS基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞后觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞及其血管的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后可使鼠尾動(dòng)脈擴(kuò)張65%，從而增加傳統(tǒng)的分次（割）放射治療的潛在療效；并且，轉(zhuǎn)基因后還可延遲腫瘤的生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Adams等[16]通過(guò)將iNOS基因治療和化療藥物順鉑聯(lián)合對(duì)前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，觀察iNOS轉(zhuǎn)染后在大部分細(xì)胞中均顯示了細(xì)胞毒作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)iNOS基因轉(zhuǎn)染還可極大地提高順鉑的細(xì)胞毒效應(yīng)。這些研究均發(fā)現(xiàn)，iNOS基因治療在很大程度上能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡以及對(duì)周圍腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)等產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。

在本研究中，我們通過(guò)高保真RT-PCR擴(kuò)增iNOS目的片段，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-iNOS。本研究選用的真核表達(dá)載體為pVAX，該質(zhì)粒含有真核基因表達(dá)調(diào)控序列、CMV啟動(dòng)子有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，卡那霉素抗性和SV40加尾信號(hào)，在真核細(xì)胞內(nèi)有高效表達(dá)活性，便于對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行體外高效轉(zhuǎn)染和體內(nèi)治療研究。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，本研究首次將pVAX-iNOS和pVAX轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)到該基因表達(dá)上調(diào)；隨后經(jīng)MTT法對(duì)轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因可明顯抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖作用，尤以48 h相對(duì)抑制最為明顯，考慮多為iNOS基因轉(zhuǎn)染48 h后表達(dá)量最高，故其抗腫瘤作用亦最為明顯；Hoechst染色和劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組及空載體組相比，轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS質(zhì)?？擅黠@誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡及抑制細(xì)胞遷移。然而，肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多基因的異常作用以及各種其它因素的影響，因此通過(guò)基因治療相互聯(lián)合或基因治療與化療藥物或放射治療聯(lián)合將極大地提高腫瘤基因治療的效果。在下一步實(shí)驗(yàn)中，我們將聯(lián)合化療藥物或放射治療，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究pVAX-iNOS基因治療對(duì)肺癌的抑制作用及抗腫瘤機(jī)制。本研究為將來(lái)肺癌基因治療奠定了一定的研究基礎(chǔ)，是臨床肺癌基因治療的一個(gè)新的探索。