李衛(wèi)民 楊振宇

1.河南省安陽縣總醫(yī)院普外一科，河南安陽 455000；2.河南省安陽市第六人民醫(yī)院胸外科，河南安陽 455000

乳腺癌是發(fā)生于乳腺的惡性腫瘤，是女性排名第一的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在亞洲乳腺癌發(fā)病年齡多在45～55歲，臨床上主要采用手術(shù)切除、放化療以及內(nèi)分泌的方法治療乳腺癌。目前發(fā)現(xiàn)乳腺癌和環(huán)境[1]（如亞硝胺[2]、病毒[3]）、飲食（缺乏維生素[4]、缺乏某些微量元素[5-6]）和遺傳因素[7]有關(guān)，但是其具體的分子機(jī)制依舊不清楚。

自分泌運(yùn)動因子受體（AMFR）又名E3泛素蛋白連接酶，位于16q21，編碼323個氨基酸。AMFR主要參與組成滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的亞結(jié)構(gòu)，它能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化降解折疊錯誤的蛋白質(zhì)，確保只有正確折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑。AMFR主要有3種配體，即自分泌運(yùn)動因子AMF、神經(jīng)營養(yǎng)因子NLK和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI，AMFR和不同的配體結(jié)合能夠發(fā)揮不同的生理作用。

目前，AMFR的研究主要集中在腫瘤方面，AMFR在許多腫瘤組織特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性的腫瘤（如膀胱癌[8]、胃癌[9]等）中表達(dá)上調(diào)，而且AMFR的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，AMFR表達(dá)比較高的患者其復(fù)發(fā)率和生存率也顯著高于AMFR表達(dá)低的患者。AMFR的表達(dá)情況在乳腺癌[10-11]中也有研究，但是AMFR表達(dá)和預(yù)后之間的關(guān)系則在國內(nèi)研究甚少。

在本實驗中，筆者在mRNA水平和蛋白水平研究了AMFR在乳腺癌中的表達(dá)情況，分析了AMFR表達(dá)和臨床之間的關(guān)系，并對AMFR表達(dá)和生存時間之間進(jìn)行了研究，探討了AMFR在乳腺癌中的診斷、治療和預(yù)后中的作用。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

為了在mRNA水平檢測AMFR的表達(dá)，筆者在2010年8月～2011年5月收集了在安陽縣總醫(yī)院普外一科手術(shù)切除的乳腺浸潤性癌及癌旁正常組織29例。手術(shù)切除的新鮮組織立即放入含有 RNAlater（Invitrogen，US）的溶液中，4℃保存過夜，以使RNAlater充分地浸入到組織中，然后-80℃凍存。

另外，還收集了80例病理診斷明確的乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織石蠟組織塊（2003年9月～2010年10月在安陽縣總醫(yī)院普外一科手術(shù)切除），術(shù)后這些患者均未進(jìn)行過系統(tǒng)的放化療治療。筆者在2011年6月采用電話和上門的方式對這些患者進(jìn)行了隨訪，患者的生存期為3～78個月，中位生存期為33個月，其他相關(guān)的臨床資料見表1。

1.2 實時熒光定量PCR

使用 TRIZOL 試劑盒提取總 RNA（Invitrogen，US），然后使用Omniscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen，Germany）合成第一鏈的cDNA。合成第一鏈cDNA后使用Agilent2100 Bioanalyzer（Agilent technologies，US）來測量合成的第一鏈cDNA的濃度。

AMFR和內(nèi)參GAPDH的引物都用Primer 5軟件合成，AMFR上游引物為5'-CACAGCGGTCAGATAGCA-3'，下游引物為5'-AAGTCCAGCGTCTCCTCC-3'，內(nèi)參GAPDH的上游引物為5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'，下游引物序列為5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3'。

使用Invitrogen的實時熒光定量PCR試劑盒，實時熒光定量PCR儀器是ABI7700，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括 1 μL cDNA，9 μL SYBR Green mix，上下游引物各 0.8 μL，ROX 0.4 μL，雙蒸水 8 μL、擴(kuò)增條件是 95°C 孵育 2 min，然后 95°C 變性 5 s，57°C 退火 30 s，68°C 延伸 30 s，進(jìn)行 40 個循環(huán)。實驗完畢后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 免疫組化分析及評價

對80例乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織進(jìn)行了免疫組化分析，所有的步驟均按照經(jīng)典的程序來。簡單來說如下，首先進(jìn)行脫蠟和水化，將石蠟切片放在二甲苯溶液中浸泡20 min，重復(fù)一次，然后使用梯度濃度的乙醇（無水乙醇、95%、90%、85%、80%）浸泡，自來水沖洗，然后在微波爐中加熱用枸櫞酸鈉緩沖液浸泡的組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗后加入H2O2溶液滅活過氧化物酶活性，然后用非免疫性動物血清BSA 37°C進(jìn)行抗原封閉30 min，棄血清后加入AMFR抗體（Abcam，Britain，1∶250 稀釋）50 μL 4°C 過夜。 最后經(jīng)PBS緩沖液沖洗之后，加入生物素標(biāo)記的二抗50 μL孵育30 min，再次經(jīng)PBS緩沖液沖洗后加入鏈霉菌抗生素過氧化物酶溶液孵育30 min后加入DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察掌握染色程度，最后用蘇木素復(fù)染，自來水沖洗后脫水、透明、封片和鏡檢。

實驗人員分別獨(dú)立地對這些免疫組化結(jié)果進(jìn)行了評價，采用的標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)細(xì)胞染色的比例進(jìn)行打分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。染色強(qiáng)度打分為，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞比例乘積得分如下：0，1，2，3，4，6，8，9，12。 ≤4 分認(rèn)為 AMFR 蛋白表達(dá)降低，≥6分認(rèn)為蛋白表達(dá)升高[12]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對實時熒光定量PCR，對乳腺癌和癌旁正常組織進(jìn)行配對樣本的t檢驗；對免疫組化結(jié)果，AMFR蛋白表達(dá)和臨床特征之間關(guān)系采用卡方檢驗；對隨訪結(jié)果，使用Kaplan-Meier的方法繪制生存曲線并用log-rank進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織mRNA水平統(tǒng)計結(jié)果

對收集的29例乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織進(jìn)行統(tǒng)計分析，方法為配對樣本t檢驗，在29例乳腺浸潤性癌中，有23例AMFR表達(dá)高于癌旁正常組織，乳腺癌的CT均值為3.06，癌旁正常組織的CT值為4.47，配對樣本t檢驗結(jié)果t值為-3.794，P=0.001，乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織AMFR表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖1。

2.2 乳腺癌和癌旁正常組織的免疫組化分析

在正常的乳腺細(xì)胞中，AMFR的蛋白主要定位于細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜，在80例乳腺浸潤性癌中，有57例AMFR表達(dá)升高，而在癌旁正常組織中，有42例AMFR蛋白表達(dá)升高，卡方檢驗結(jié)果為χ2=5.961，P=0.015，在AMFR蛋白水平，乳腺癌和癌旁正常組織表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖2、3。

2.3 乳腺癌中AMFR蛋白表達(dá)和臨床之間的關(guān)系

使用卡方檢驗對AMFR蛋白在乳腺浸潤性癌表達(dá)情況與臨床特征之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計分析探討，在80例乳腺浸潤性癌中有57例AMFR蛋白表達(dá)升高（分?jǐn)?shù)≥6分），而表達(dá)降低的僅有23例（≤4分）。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中的AMFR表達(dá)水平和病變大?。é?=4.929，P=0.026）、T 期（χ2=9.235，P=0.010）、N 期（χ2=5.740，P=0.017）和 M 期（χ2=13.518，P<0.001）有關(guān)，而與年齡無關(guān)（χ2=0.188，P=0.665）無關(guān)。見表1。

表1 乳腺癌中AMFR蛋白表達(dá)和臨床之間的分析（n）

2.4 生存分析

筆者在2011年6月采用電話和上門的方式對這80例患者進(jìn)行了隨訪，患者的生存期為3～78個月，中位生存期為33個月。為了探討AMFR表達(dá)和預(yù)后之間的關(guān)系，使用了Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗的方法。發(fā)現(xiàn)AMFR表達(dá)水平和總的生存率有關(guān)，AMFR表達(dá)增高的患者生存時間比較短。AMFR表達(dá)降低的患者的平均生存期為44.73個月，中位生存期為31個月，而表達(dá)AMFR升高的患者生存期為25.651個月，中位生存期為20個月，log-rank檢驗表明這兩組之間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.071，P=0.008）。生存曲線如圖4。

3 討論

自分泌運(yùn)動因子受體AMFR又名E3泛素蛋白連接酶，它能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中清除折疊錯誤的蛋白[13]。AMFR與不同的配體結(jié)合能發(fā)揮不同的作用，目前研究發(fā)現(xiàn)其主要有3種配體，即：自分泌運(yùn)動因子AMF、神經(jīng)營養(yǎng)因子NLK和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI。AMFR與AMF結(jié)合可以刺激細(xì)胞的運(yùn)動，與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]；與NLK結(jié)合與神經(jīng)元的生長、存活有關(guān)[15-16]；而與PGI結(jié)合則與糖代謝有關(guān)[17]。

AMFR在腫瘤中研究的比較多，在浸潤性導(dǎo)管癌組織中AMFR表達(dá)水平明顯高于正常乳腺上皮，組織學(xué)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級癌組織表達(dá)強(qiáng)度逐漸升高，說明AMFR與乳腺癌的發(fā)生、分化程度都有關(guān)[11]；在肝癌轉(zhuǎn)移組織中，AMFR的mRNA顯著高于未轉(zhuǎn)移組，說明AMFR與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]；在胃癌中也發(fā)現(xiàn)了AMFR表達(dá)增加，并且AMFR與TNM分期有關(guān)[9]。此外，在膀胱癌[8]、舌癌[19]和肺癌[20]等多個組織都都有AMFR表達(dá)的升高，但是在乳腺癌中還沒有將AMFR與預(yù)后聯(lián)系的報道。

本文通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中AMFR的mRNA表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步使用免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)在80例乳腺癌中有57例AMFR蛋白表達(dá)升高，與癌旁正常組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過與臨床特征之間分析發(fā)現(xiàn)，AMFR表達(dá)與病變長度、T期、N期和M期有關(guān)，但是與性別和年齡差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。生存分析發(fā)現(xiàn)AMFR表達(dá)與患者生存率有關(guān)，AMFR表達(dá)增高的患者生存時間比較短。log-rank檢驗表明AMFR表達(dá)增高與表達(dá)降低之間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明AMFR的表達(dá)可以作為一個預(yù)后指標(biāo)。

應(yīng)該指出的是，由于本研究是單一醫(yī)院的回顧性研究，由于有不可測量的誤差存在而可能影響實驗結(jié)果。所以為了進(jìn)一步研究清楚AMFR在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，多中心多點(diǎn)的回顧性研究是必須的。

通過研究發(fā)現(xiàn)，AMFR在乳腺癌中表達(dá)升高，而且其表達(dá)高低還與預(yù)后有關(guān)，抑制其表達(dá)或者活性可能成為腫瘤治療的一種新方法新模式，AMFR可能也是腫瘤治療的一個新靶點(diǎn)和預(yù)后新指標(biāo)，這需要做進(jìn)一步的研究。

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