高建，鄭倩倩，李彥姝，周末

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心三部；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要表現(xiàn)，也是導(dǎo)致進(jìn)展期胃癌預(yù)后差的根本原因。上皮間質(zhì)化在上皮來源的惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用。細(xì)胞骨架的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能以及病理變化成為研究熱點(diǎn)［1～3］。近期研究報(bào)道，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變與上皮間質(zhì)化發(fā)生相關(guān)［4，5］，上皮間質(zhì)化發(fā)生后可使某些細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)缺失或錯(cuò)誤定位。微絲對(duì)細(xì)胞黏附、鋪展、運(yùn)動(dòng)、內(nèi)吞、分裂具有重要調(diào)節(jié)作用。通過預(yù)染微絲來反映細(xì)胞骨架變化，已經(jīng)成為人們研究細(xì)胞形態(tài)變化、腫瘤侵襲遷移的重要手段。本實(shí)驗(yàn)主要采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察3種固定液對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的微絲和細(xì)胞連接蛋白Zo-1的影響，探討不同固定液對(duì)細(xì)胞骨架和連接蛋白固定效果，選擇最佳固定方法，為進(jìn)一步研究胃腸腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)缺失或錯(cuò)誤定位提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

胃癌細(xì)胞系SGC-7901為我校細(xì)胞生物學(xué)教研室保存。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Triton X-100，購(gòu)自日本TaKaRa公司；BSA、FITC-Phalloidin、DAPI，購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Zo-1-FITC，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。激光共聚焦顯微鏡（FV-1000），購(gòu)自日本OLYMPUS公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL和1×106/mL，分別接種于含蓋玻片的12孔板，培養(yǎng)12 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察SGC-7901細(xì)胞在不同固定液處理下的微絲和連接蛋白

2種密度的細(xì)胞均分別用4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和95%乙醇室溫固定20 min，PBS沖洗3次，每次10 min。5%BSA（含0.2%Triton X-100）封閉透膜1 h。PBS沖洗3次，每次5 min。加入FITC-Phalloidin抗體于低密度細(xì)胞，室溫避光孵育1 h。Zo-1-FITC抗體加到高密度細(xì)胞，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗3次，每次10 min。DAPI染核，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次10 min。60%甘油封片，用OLYMPUS FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行掃描，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。

2 結(jié)果

2.1 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901細(xì)胞骨架形態(tài)

4%多聚甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，微絲結(jié)構(gòu)完整，呈細(xì)絲拉網(wǎng)狀，層次清晰，有較強(qiáng)的立體感，胞質(zhì)及胞核區(qū)干凈無非特異染色（圖1B）。與細(xì)胞核圖像融合后發(fā)現(xiàn)2種熒光無竄色現(xiàn)象（圖1C）。

2.2 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901細(xì)胞骨架形態(tài)

用2.5%戊二醛固定細(xì)胞后，細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)基本完整，在細(xì)胞的外周胞膜處可觀察到較完整的網(wǎng)絡(luò)體系，而細(xì)胞內(nèi)部微絲熒光染色標(biāo)記效果模糊，部分以高信號(hào)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在胞質(zhì)及胞核周圍，不易分辨出清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2B）。疊加圖像亦清晰，無竄色現(xiàn)象（圖2C）。

2.3 用95%乙醇固定的SGC-7901細(xì)胞骨架形態(tài)觀察

細(xì)胞經(jīng)過95%乙醇固定后形態(tài)欠規(guī)整，細(xì)胞外周微絲骨架結(jié)構(gòu)略模糊。微絲纖維之間的區(qū)分不明顯，排列較亂，出現(xiàn)了類似核仁定位的綠色熒光信號(hào)非特異性高表達(dá)（圖3B）。

2.4 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901細(xì)胞間連接蛋白形態(tài)

使用4%多聚甲醛固定處理細(xì)胞后，可觀察到細(xì)胞密集區(qū)出現(xiàn)Zo-1綠色熒光信號(hào)高表達(dá)，定位于鄰近細(xì)胞緊密連接處，細(xì)胞核區(qū)中空，細(xì)胞質(zhì)見低表達(dá)的熒光信號(hào)（圖4B），疊加圖像可見Zo-1定位清晰，疊加染色無變化（圖4C）。

2.5 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901細(xì)胞間連接蛋白形態(tài)

使用2.5%戊二醛固定細(xì)胞后，選擇細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行圖像采集，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)呈均一性非特異高信號(hào)熒光染色，核區(qū)亦出現(xiàn)了類似核仁結(jié)構(gòu)的綠色熒光信號(hào)高表達(dá)（圖5B）。疊加圖像無特異性Zo-1定位，且出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，疊加顏色變成青綠色（圖5C）。

2.6 用95%乙醇固定的SGC-7901細(xì)胞間連接蛋白形態(tài)

用95%乙醇固定細(xì)胞后進(jìn)行激光共聚焦掃描顯微鏡采圖，熒光標(biāo)記效果介于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛之間?？梢杂^察到較為明顯的Zo-1表達(dá)及定位于細(xì)胞間緊密連接，但胞質(zhì)和胞核區(qū)呈現(xiàn)略強(qiáng)的彌漫性非特異熒光信號(hào)（圖6B）。

3 討論

激光共聚焦掃描顯微鏡由于激光和熒光的共聚焦成像以及針孔應(yīng)用，阻止了焦點(diǎn)以外的干擾衍射光和散射光。常用的避免或排除光譜交叉干擾方法有很多種，如同時(shí)使用幾種熒光探針、降低標(biāo)記熒光強(qiáng)度以及采用序列掃描等方法。本實(shí)驗(yàn)通過使用不同波長(zhǎng)激光依次激發(fā)樣品，同時(shí)在相應(yīng)的熒光檢測(cè)通道輪流采集并顯示每種熒光的共聚焦的序列掃描方式，避免了熒光竄色現(xiàn)象的發(fā)生。而為了觀察細(xì)胞內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)，確保抗體與其對(duì)應(yīng)抗原自由結(jié)合，細(xì)胞首先必須固定和打孔。免疫熒光方法中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體，將抗原穩(wěn)定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定劑應(yīng)能保持細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真實(shí)性，并使抗體大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合［6］。一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的固定劑分為兩大類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑［7］。有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

目前，尚無一種標(biāo)準(zhǔn)固定劑適用于各種抗原的固定，本實(shí)驗(yàn)所采用的3種固定劑在功能上各有優(yōu)缺點(diǎn)。多聚甲醛通過交聯(lián)作用更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但同時(shí)也可能降低一些細(xì)胞組分的抗原性，細(xì)胞胞膜相關(guān)組分、細(xì)胞器及細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般以多聚甲醛固定。相關(guān)研究提示，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞對(duì)抗原有很好的保護(hù)作用，但Zo-1信號(hào)表現(xiàn)得比較模糊，不及用甲醇固定的細(xì)胞表達(dá)得銳利結(jié)實(shí)［8］，可能與其對(duì)組織穿透力強(qiáng)、保存抗原的免疫活性較好有關(guān)。而有文獻(xiàn)報(bào)道，使用甲醇固定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致GFP的熒光消失，而使用4%多聚甲醛固定時(shí)GFP的熒光就沒有失去［9］，這也提示我們要針對(duì)不同的觀察對(duì)象選擇適合的固定劑。戊二醛可通過固定核蛋白來固定組織和細(xì)胞中的DNA和RNA，能保存糖原，但不能避免其他環(huán)節(jié)造成的脂類抽提，因而對(duì)細(xì)胞膜的固定效果不理想。而乙醇除有機(jī)溶劑固定的優(yōu)點(diǎn)之外，也有不足之處：可溶解脂類物質(zhì)；對(duì)組織收縮較大，不宜作單純固定液；滲透力不強(qiáng)；可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白等。通過掃描結(jié)果分析，對(duì)于細(xì)胞骨架的固定可選擇單純的4%多聚甲醛或者添加一些高效去污力的穩(wěn)定劑（針對(duì)多聚甲醛易因?yàn)榻宦?lián)作用而造成的雜質(zhì)污染）。對(duì)于細(xì)胞間連接等胞膜蛋白，可選擇4%多聚甲醛或甲醇進(jìn)行固定。通過細(xì)致的比較、合理的使用固定劑，對(duì)于樣本制備以及后期掃描觀察結(jié)果起到至關(guān)重要作用，為后續(xù)深入研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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