熊 玲，張立彥，劉啟蓮

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種天然多肽抗菌素類物質(zhì)，是一種世界公認(rèn)的、安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑［1］，主要用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鮮。但Nisin抗菌譜窄，其活性易受到溫度、pH等因素的影響，且抗菌時效短［2］。保持Nisin的活性是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，Nisin在酸性條件下有著較好的熱穩(wěn)定性，但在高溫處理時不可避免存在著活性損失［3］。因此，如何穩(wěn)定Nisin的抑菌活性，延長其作用期限成為擴(kuò)展其應(yīng)用的重要課題。劉麗莉［4］等研究了不同的酸溶液、金屬陽離子、離子強(qiáng)度及pH等非生物性因素對Nisin抗菌活性的影響，實驗結(jié)果表明，乙酸對Nisin的抗菌活性的提高效果最顯著;金屬離子會提高Nisin的抗菌活性，離子強(qiáng)度的增加對Nisin的抗菌活性有較大的提高［5］。而不同陰離子對Nisin抑菌活性的影響還未見有研究報道。鑒于上述，本實驗主要研究不同磷酸鹽、檸檬酸鈉和EDTA二鈉在不同pH、溫度條件下對Nisin的活性保護(hù)作用，旨在為Nisin在食品和醫(yī)藥業(yè)更廣泛的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃微球菌 生物試劑，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司提供;乳酸鏈球菌素 食品級，浙江銀象生物工程有限公司提供;三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、EDTA二鈉等 均為分析純，購自天津市華苑產(chǎn)業(yè)區(qū)鑫茂科技園。

LDZX-30FA型手提式不銹鋼蒸汽消毒器 江陰頂江機(jī)械設(shè)備有限公司;DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;DK98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器公司;BSD-150型水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Model752型紫外可見分光光度計 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司;SW-CJ-IF型無菌操作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Nisin效價測定

1.2.1.1 檢測菌菌懸液的制備 用營養(yǎng)瓊脂制得斜面培養(yǎng)基，將檢測菌藤黃微球菌接種到斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h。置于冰箱冷藏備用，儲存期不超過14d。制備檢測菌菌懸液時，用無菌生理鹽水從斜面洗下檢測菌接入300mL種子培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉 5g/L，pH7.0，115℃滅菌 15min)中，稀釋成濃度為107～108cfu/mL放入搖床中培養(yǎng)6h，轉(zhuǎn)速150r/min，33℃。取出置于冰箱中備用，作為檢測時的種子液。

1.2.1.2 CM檢測培養(yǎng)基的制備 Tween20與水(體積比1∶1)混合物2g/L，胰蛋白胨8g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氫二鈉2g/L，pH6.80，121℃滅菌 15min。

1.2.1.3 Nisin效價的測定 準(zhǔn)確稱取10mg Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(103IU/mg)，溶于10mL 0.02 mol/L HCl中，配制成103IU/mL Nisin標(biāo)準(zhǔn)液備用。效價測定采用分光光度計法［6］測定。

1.2.1.4 Nisin效價損失率計算公式

其中，C1是指不經(jīng)處理Nisin的效價，C2是指添加離子溶液后Nisin的效價。

1.2.2 溫度和pH對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響 現(xiàn)配好的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液分別用1mol/L NaOH和1mol/L HCl調(diào)節(jié)至不同 pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，之后在不同溫度(30、45、60、75、90、110、121℃)下處理20min，以未經(jīng)加熱處理和未調(diào)節(jié)pH的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液作為對照，一起進(jìn)行抑菌效果實驗。研究相應(yīng)溫度及pH下Nisin的效價損失率。

1.2.3 不同陰離子對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響 將0.1mol/L的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、EDTA二鈉、三聚磷酸鈉、檸檬酸鈉、六偏磷酸鈉溶液，按一定的添加量添加到配好的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液中，分別調(diào)節(jié)至不同的 pH(2.0、4.0、5.5、6.0、6.5、6.8)，然后分別在不同溫度(30、45、60、75、90、110、121℃)下保持 20min，測定其效價，考察在不同溫度及pH下，不同離子對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和pH對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖1可看出，隨著溫度的升高，Nisin的效價損失率也隨之逐漸升高，其抑菌活性減弱。當(dāng)pH在2.0～4.0時，Nisin的效價損失率在30℃時幾乎無損失，之后隨著溫度的升高逐漸升高。當(dāng)pH5時，在30～60℃，效價損失率在25%左右，到121℃時接近70%。當(dāng)pH分別為6.0、7.0時，在30℃下的效價損失率就已經(jīng)較大，121℃時幾乎接近100%，基本完全喪失活性。總的來說，在強(qiáng)酸性環(huán)境下，低溫對Nisin活性的影響不大，但在高溫時，其穩(wěn)定性顯著降低，在偏中性環(huán)境下，Nisin的活性損失更為嚴(yán)重，溫度對其影響要比在強(qiáng)酸性環(huán)境下溫度的影響要大得多。由此可知，溫度和pH對Nisin的抑菌穩(wěn)定性有很大影響。

2.2 磷酸二氫鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

圖1 溫度及pH對Nisin活性的影響Fig.1 Effect of temperature and pH on the activity of Nisin

如圖2所示，添加磷酸二氫鈉后，Nisin的效價損失率也隨著溫度的升高而逐漸升高。在強(qiáng)酸性范圍(pH2.0～4.0)，Nisin活性隨溫度的升高而降低，但變化較不添加時(圖1)緩慢，如121℃、pH4.0時，效價損失率由未加時61.6%降至41.4%，說明磷酸二氫鈉的添加對Nisin的活性有一定的保護(hù)作用。在pH5.0～6.5范圍內(nèi)，Nisin活性隨溫度升高而快速降低，且溫度一定時，Nisin活性損失與處理pH呈正相關(guān)，即pH越大，活性損失越嚴(yán)重。這可能是因為磷酸二氫鈉屬于正磷酸鹽，它的螯合作用和持水作用是磷酸鹽中最弱的，對Nisin分子的活性基團(tuán)的保護(hù)作用有限。

圖2 磷酸二氫鈉對Nisin活性的影響Fig.2 Effect of sodium dihydrogen phosphate on the activity of Nisin

2.3 磷酸氫二鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖3所示，添加磷酸氫二鈉后，Nisin的效價損失率仍隨著溫度升高而逐漸升高。在低溫范圍內(nèi)(30～75℃)，Nisin活性的變化趨勢較為平緩，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，其活性損失也急劇增大。Nisin的抑菌穩(wěn)定性變化趨勢與添加磷酸二氫鈉時基本一樣，但在低溫時抑菌效果不如磷酸二氫鈉。如在pH5.5，30℃時，添加了磷酸氫二鈉的Nisin效價損失率為32.6%，而添加磷酸二氫鈉的效價損失率僅為18.2%。但是在高溫、高pH范圍內(nèi)，兩者的作用效果差不多，Nisin活性損失都比較嚴(yán)重，對Nisin活性幾乎沒有保護(hù)作用，如在pH6.0～6.8范圍內(nèi)，121℃溫度下保持20min，效價損失率幾乎達(dá)到100%。

2.4 EDTA二鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，添加EDTA二鈉時，Nisin效價損失率隨著溫度的升高而逐漸升高，但在強(qiáng)酸性范圍(pH2.0～4.0)變化很緩慢，在弱酸性及近中性范圍(pH5.5～6.8)內(nèi)變化則相對較快;隨著pH的升高，Nisin效價損失率也基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。但是，即使在高溫、高pH的條件下，效價損失率還是非常低的，最高也僅為10.2%，其保護(hù)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過NaH2PO4和Na2HPO4。因此，EDTA二鈉對 Nisin的活性具有極強(qiáng)的保護(hù)作用，可能是因為它結(jié)合Nisin分子阻礙了藤黃微球菌正常的細(xì)胞壁合成［7］。T.Economou［8］等研究了EDTA二鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明50mmol/L的EDTA二鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性有很強(qiáng)的保護(hù)作用，與本實驗的結(jié)果相一致。EDTA二鈉作為一種螯合劑，可與充當(dāng)膜上大分子如脂多糖之間鹽橋二價陽離子螯合，使細(xì)菌的細(xì)胞膜失穩(wěn)，從而具有一定的抗菌效果。但據(jù)楊萬根［9］、杜琨［10］等人的報道，認(rèn)為單獨使用EDTA二鈉的殺菌效果并不明顯，其只有與Nisin或溶菌酶復(fù)合使用時才表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。

圖3 磷酸氫二鈉對Nisin活性的影響Fig.3 Effect of sodium hydrogen phosphate on the activity of Nisin

圖4 EDTA二鈉對Nisin活性的影響Fig.4 Effect of EDTA-Na2on the activity of Nisin

2.5 檸檬酸鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖5所示，添加檸檬酸鈉后Nisin效價損失率受溫度和pH的影響變化趨勢和未添加的類似，即隨著溫度和pH的升高效價損失率降低(90℃、110℃時pH6.5和pH6.8之間例外)。

圖5 檸檬酸鈉對Nisin活性的影響Fig.5 Effect of sodium citrate on the activity of Nisin

與圖1對比可知，添加檸檬酸鈉后Nisin的效價損失率有下降的趨勢，如pH4.0、75℃時，未添加檸檬酸鈉的Nisin效價損失率為30%，添加檸檬酸鈉之后為22%，效價損失率降低了26.67%;pH6.0、90℃時，未添加檸檬酸鈉的Nisin效價損失率為89%，添加檸檬酸鈉之后為75%，效價損失率降低了15.73%。說明檸檬酸鈉對Nisin也起到了一定保護(hù)作用，其保護(hù)作用強(qiáng)于磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于EDTA二鈉。

2.6 三聚磷酸鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，效價損失率隨著溫度的升高而逐漸升高;在相同溫度下，pH越大，效價損失率越大。但是，對比發(fā)現(xiàn)添加三聚磷酸鈉后Nisin的效價損失率比未添加時有大幅度降低，如pH6.0、121℃時Nisin的效價損失率由未添加的91%降至56%，下降幅度為38.46%，其他條件下Nisin的效價損失率也分別有較大幅度的下降，說明三聚磷酸鈉對Nisin的抑菌穩(wěn)定性起到了積極的保護(hù)作用，其保護(hù)效果強(qiáng)于磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和檸檬酸鈉，強(qiáng)于前兩者是因為磷酸鹽的作用特性與鏈長有關(guān)［11］。P2O5在三聚磷酸鈉中的含量比正磷酸鹽高，脫水聚合方式不同導(dǎo)致三聚磷酸鈉的鏈長(聚合度)比正磷酸鹽大，而磷酸鹽對Nisin保護(hù)效果又與鏈長成正比，鏈長越長，作用越顯著。但是三聚磷酸鈉的作用效果不如EDTA二鈉的強(qiáng)。

圖6 三聚磷酸鈉對Nisin活性的影響Fig.6 Effect of sodium tripolyphosphate on the activity of Nisin

2.7 六偏磷酸鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，添加了六偏磷酸鈉后Nisin效價損失率比未添加時有了很大降低，損失率均在8%以下。如在pH4、60℃下，Nisin的效價損失率由未添加時的26%降為0.2%，說明六偏磷酸鈉對Nisin起到了很強(qiáng)的保護(hù)作用，減少了其效價損失。分析上述曲線可以發(fā)現(xiàn)，在酸性條件(pH2～5.5)下，Nisin的效價損失率保持較低水平，溫度低于60℃時，幾乎沒有效價損失。在偏中性條件(pH6.0～6.8)下，Nisin效價損失率明顯高于偏酸性條件，突變 pH范圍為5.5～6.0?？偟膩碚f，由于六偏磷酸鈉的保護(hù)作用，整體損失率并不高，可能是因為六偏磷酸鈉改變了Nisin分子中的疏水及靜電結(jié)合，擴(kuò)大相鄰分子空間，增加了保水性，另外促使Nisin的親水基團(tuán)露出，可以吸收更多的水分，形成了保護(hù)膜，保護(hù)了Nisin的活性［12］。與前面的幾種物質(zhì)比較，六偏磷酸鈉對Nisin抑菌穩(wěn)定性的作用效果最顯著，明顯高于其他磷酸鹽和檸檬酸鈉。

圖7 六偏磷酸鈉對Nisin活性的影響Fig.7 Effect of sodium hexametaphosphate on the activity of Nisin

3 結(jié)論

3.1 pH、溫度對Nisin抑菌穩(wěn)定性有較大影響，隨著處理溫度及pH的升高，Nisin的效價損失率隨之升高，其抑菌活性減弱。

3.2 不同含鈉陰離子(磷酸鹽、EDTA二鈉、檸檬酸鈉)對Nisin的抑菌活性有一定的保護(hù)作用，且保護(hù)效果由大到小排序為:六偏磷酸鈉＞EDTA二鈉＞三聚磷酸鈉＞檸檬酸鈉＞磷酸二氫鈉＞磷酸氫二鈉。六偏磷酸鈉在pH=6.8、121℃條件處理下，Nisin效價損失率為7.25%，相同條件下EDTA二鈉為10.2%。

［1］李紅，趙春燕.乳酸鏈球菌素的研究進(jìn)展［J］.食品科技，2006(1):75-78.

［2］溫斯穎，韓衍青.超高壓協(xié)同乳酸鏈球菌素抑制低溫火腿中的耐壓腐敗菌［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(1):56-59.

［3］Roollema H S，Kuipers O P，Both P，et al.Improvement of solubility and stability of the antimicrobial peptide Nisin by protein engineering［J］.Applied and Environmental Microbiology，1995，61(8):2873-2878.

［4］劉麗莉，馬美湖，楊協(xié)力，等.非生物性因素對乳酸鏈球菌素抗菌活性的影響［J］.食品科學(xué)，2009，30(5):46-49.

［5］劉穎.復(fù)合磷酸鹽食品添加劑的開發(fā)及應(yīng)用研究［D］.貴州:貴州大學(xué)，2008.

［6］吳兆亮，賈永生，譚相偉，等.分光光度法快速測定乳鏈菌肽效價［J］.分析化學(xué)，2006，34:227-230.

［7］張春江.低溫熏煮香腸的貯藏保鮮研究［D］.山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［8］T Economou，N Pournis，A Ntzimani，et al.Nisin-EDTA treatments and modified atmosphere packaging to increase fresh chicken meat shelf-life［J］.Food Chemistry，2009，114(4):1470-1476.

［9］楊萬根，馬美湖，張鳳凱.三種抗菌劑在肉制品中的應(yīng)用［J］.肉類工業(yè)，2002(8):20-27.

［10］杜琨.Nisin和EDTA聯(lián)合抑制金黃色葡萄球菌效果研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):1016-1019.

［11］馬仲明.柔性化食品添加劑磷酸鈉鹽裝置的工程設(shè)計［D］.云南:昆明理工大學(xué)，2005.

［12］Naomi E K，Eddy J S，Jan K，et al.Resistance of Grampositive bacteria to nisin is not determined by Lipid II levels［J］.FEMS Microbiology Letters，2004，239:157-161.