黃滟波，魏 東

(1.華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

丙烯酰胺是一種常用的化工原料，廣泛用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、生殖毒性，可以引起動(dòng)物的致畸、致癌［1］。1994年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其歸為人類潛在的致癌物［2］。2002年4月，瑞典國家食品管理局首次從某些高溫加工食品中檢出高含量的丙烯酰胺，如油炸薯?xiàng)l、薯片、炸雞翅、面包等，其最高含量達(dá)到12800μg/kg［3］。這一結(jié)果引起了國際社會(huì)廣泛重視，各國紛紛針對食品加工過程中丙烯酰胺的形成機(jī)理及抑制方法展開大量的研究。丙烯酰胺形成于食品的高溫加熱過程中，而食品基質(zhì)非常復(fù)雜，影響因素眾多，這些就為對丙烯酰胺進(jìn)行深入研究帶來了一定的困難。目前一般認(rèn)為，丙烯酰胺是天冬酰胺和還原糖在高溫加熱(大于120℃)條件下，由美拉德反應(yīng)生成［4］，研究中常采用化學(xué)模型模擬丙烯酰胺的形成過程。利用化學(xué)模型進(jìn)行研究可以忽略丙烯酰胺形成過程中的次要因素，抓住天冬酰胺和還原糖這一對影響丙烯酰胺形成的主要因素，對于簡化研究過程，減少因復(fù)雜基質(zhì)影響而形成的誤差有重要的幫助［5］。同時(shí)，由于食品加工過程復(fù)雜，影響因素眾多，因此，還需要建立真實(shí)食品模型對化學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以提高篩選過程的準(zhǔn)確性。本文旨在建立模擬丙烯酰胺形成過程的化學(xué)模型，并對其進(jìn)行優(yōu)化以作為丙烯酰胺抑制劑的篩選平臺(tái)。同時(shí)建立形成丙烯酰胺的食品模型，用于化學(xué)模型的驗(yàn)證參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙烯酰胺 99%，Sigma－Aldrich;無水葡萄糖、天冬酰胺、無水硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、溴化鉀、溴酸鉀、硫代硫酸鈉、氯化鈣 均為分析純;土豆 購于廣州市場;金龍魚大豆油 南海油脂工業(yè)(赤灣)有限公司。

6890－5975 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent Technologies;DB－FFAP毛細(xì)管氣相色譜柱 Agilent Technologies;U－3900紫外分光光度計(jì) Hitachi;恒溫油浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠;不銹鋼密封管、試管架 自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)模型的建立 自制長約100mm、內(nèi)徑約10mm的不銹鋼螺口密封管，耐200℃高溫的密封墊及螺口試管蓋，確保試管在裝有液體高溫加熱時(shí)密閉性良好。將試管架放入油浴鍋中，加熱，使其升溫至170℃并保持穩(wěn)定。在不銹鋼密封管中分別加入一定量的葡萄糖、天冬酰胺及去離子水，混勻后加上墊圈及試管蓋，密閉。將裝有反應(yīng)物的密封管放入試管架并迅速置于油浴鍋中，開始計(jì)時(shí)。5min后，迅速取出密封管，置入冰水中冷卻。待其冷卻后，取出反應(yīng)液稀釋至40mL。取其中20mL溴化衍生檢測其丙烯酰胺含量，再取余下液體稀釋2倍后檢測其在420nm處吸光值。

1.2.2 食品模型的建立 油浴鍋中加入約1L市售大豆油，加熱到一定溫度(150℃或170℃)并保持穩(wěn)定。選取市售新鮮土豆，清洗、去皮，切為約2mm厚、40mm直徑的薄片，置入蒸餾水中浸泡3min，取出，用濾紙吸去表面多余水分，加入熱油中炸一定時(shí)間，取出，用濾紙吸取表面多余油脂，粉碎，溴化衍生檢測其丙烯酰胺含量，并將水提液稀釋20倍后檢測其在420nm處的吸光值。

1.2.3 丙烯酰胺的檢測

1.2.3.1 溴化衍生 取20mL反應(yīng)液加入CarrezⅠ、CarrezⅡ試劑各0.5mL。振蕩2min后于4℃、14000r/min離心15min，取10mL離心上清液，加入2g溴化鉀、2mL 0.1mol/L溴酸鉀溶液、1.2mL硫酸(10%，V/V)進(jìn)行溴化衍生，4℃避光靜置1h后，再加入 1mL 0.2mol/L硫代硫酸鈉溶液終止溴化反應(yīng)。溴化后溶液約11mL用10mL乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次，取乙酸乙酯層，于45℃、90kPa減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1mL。加入0.1mL三乙胺，進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。

1.2.3.2 GC－MS分析 毛細(xì)管色譜柱:DB－FFAP(30m ×0.25mm ×0.25μm);進(jìn)樣量:1μL;載氣:氦氣;載氣流速:1mL/min;升溫程序:60℃保持2min，然后以10℃/min的速度升溫到200℃，保持5min。

電離方式:EI源;離子源溫度:230℃;四級桿溫度:150℃;掃描方式:選擇離子掃描(SIM)模式，檢測離子為 m/z=106、133、151;質(zhì)量掃描范圍:33～550。

1.2.4 抑制劑的篩選 以在化學(xué)模型中加入3mL去離子水為空白，加入3mL 0.5%的氯化鈣溶液為陽性對照，按前所述方法加熱，并檢測其丙烯酰胺含量。

以將土豆片在蒸餾水中浸泡3min作為空白，將土豆片在0.5%氯化鈣溶液浸泡3min作為陽性對照，按前述方法油炸并分別檢測其丙烯酰胺含量。

化學(xué)模型及食品模型中，添加劑對丙烯酰胺的抑制率按以下方法計(jì)算:

抑制率(%)=(D－E)/D×100

式中，D:模型中丙烯酰胺的產(chǎn)生量(mg/L或mg/kg);E:添加抑制劑后模型中丙烯酰胺的產(chǎn)生量(mg/L或mg/kg)。

抑制率為正值時(shí)，表示有抑制作用;抑制率為負(fù)值時(shí)，表示有促進(jìn)作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)模型含水量的選擇

文獻(xiàn)［6－7］在研究影響丙烯酰胺形成各因素時(shí)，采用了無水天冬酰胺/還原糖模型，將等摩爾比的天冬酰胺/還原糖粉末仔細(xì)混勻后進(jìn)行加熱。反應(yīng)后產(chǎn)物采用UPLC－MS/MS或GC－MS檢測，檢測結(jié)果較穩(wěn)定。因此，在化學(xué)模型建立過程中，本研究先嘗試建立無水模型體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在170℃高溫加熱之后，無水葡萄糖與天冬酰胺的產(chǎn)物結(jié)塊膨脹，在將其轉(zhuǎn)移出不銹鋼密封管溶于去離子水的過程中損失較大。葡萄糖、天冬酰胺粉末在混合過程中，混勻程度不易掌握，而且與溶液相比固體傳熱較慢，因此在加熱過程中葡萄糖、天冬酰胺粉末在試管內(nèi)受熱不均勻，反應(yīng)結(jié)果重復(fù)性較差，從肉眼便可觀察到各平行樣中反應(yīng)程度差別較大。因此，在之后的研究中未采用無水模型體系。

2.2 化學(xué)模型中葡萄糖與天冬酰胺的添加量的選擇

化學(xué)模型中初始反應(yīng)物的濃度及比例、加熱溫度、加熱時(shí)間等因素都會(huì)影響化學(xué)模型中丙烯酰胺的形成［8］。其中還原糖與天冬酰胺的摩爾比這一因素對化學(xué)模型中丙烯酰胺的形成有較大影響［6］。文獻(xiàn)［9］表明按照三種不同的葡萄糖/天冬酰胺摩爾比例(1∶3，1∶1 和 3∶1)制備化學(xué)模型反應(yīng)物，當(dāng)葡萄糖/天冬酰胺摩爾比例在1∶1～2∶1時(shí)，丙烯酰胺產(chǎn)生量較高。鑒于許多研究采用的化學(xué)模型中葡萄糖與天冬酰胺的摩爾比為1∶1［10］，本章未再深入探討葡萄糖/天冬酰胺摩爾比例對丙烯酰胺產(chǎn)生量的影響，而是在確定葡萄糖/天冬酰胺摩爾比為1∶1的條件下，探討三種不同的葡萄糖/天冬酰胺添加量在模型中產(chǎn)生丙烯酰胺的情況，結(jié)果如表1所示。

表1 三種Glu/Asn添加量在模型中產(chǎn)生丙烯酰胺的情況Table 1 Yield of acrylamide in three Glu/Asn contents in model system

當(dāng)模型中Glu/Asn的添加量為0.500g/0.600g時(shí)，產(chǎn)物進(jìn)行 GC－MS檢測，發(fā)現(xiàn)總離子流圖在15.291min時(shí)并未有峰。將此樣品按相同的色譜條件進(jìn)行檢測，質(zhì)譜采用全掃描(Scan)模式收集信號，發(fā)現(xiàn)在12.553min時(shí)，有較大峰出現(xiàn)，經(jīng)質(zhì)譜圖檢索確定該峰為丙烯酰胺單體。究其原因，可能是因?yàn)镚lu/Asn添加量為0.500g/0.600g時(shí)，模型中產(chǎn)生的丙烯酰胺量過多，以至于在對丙烯酰胺進(jìn)行溴化衍生時(shí)溴化反應(yīng)不完全，體系中仍有大量丙烯酰胺單體存在，使得色譜圖中主要峰為丙烯酰胺，主峰拖尾覆蓋了溴化產(chǎn)物峰，影響了溴化丙烯酰胺的檢出。

當(dāng)模型中Glu/Asn的添加量為0.010g/0.012g和0.050g/0.060g時(shí)，產(chǎn)生丙烯酰胺的平均量分別為1.26mg/L和4.39mg/L，RSD均在10%內(nèi)，平行樣間的穩(wěn)定性較好。GC/MS分析結(jié)果顯示，溴化反應(yīng)基本完全?？傠x子流圖在15.291min處有2－溴丙烯酰胺峰出現(xiàn)，而在12.553min，未發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺單體。

綜合以上結(jié)果可見，當(dāng) Glu/Asn添加量為0.500g/0.600g時(shí)，產(chǎn)生丙烯酰胺量過多，影響溴化效率;當(dāng) Glu/Asn添加量為0.010g/0.012g和0.050g/0.060g時(shí)溴化反應(yīng)基本完全，模型較為穩(wěn)定。0.050g/0.060g與0.010g/0.012g相比，反應(yīng)物質(zhì)量增加到5倍，檢測到丙烯酰胺產(chǎn)量未成正比增加。考慮到反應(yīng)物添加量較低，稱量時(shí)更容易引入誤差，因此選取Glu/Asn添加量為0.050g/0.060g作為丙烯酰胺化學(xué)模型中的反應(yīng)物加入量。

2.3 化學(xué)模型反應(yīng)溫度、時(shí)間的選擇

2.3.1 反應(yīng)溫度、時(shí)間對化學(xué)模型丙烯酰胺生成量的影響 Glu/Asn添加量為0.050g/0.060g時(shí)，分別在 150、170℃油浴加熱 2、4、5、6、8min，冷卻后檢測其丙烯酰胺含量，結(jié)果見圖1。

在150℃和170℃兩種不同的溫度條件下，化學(xué)模型中丙烯酰胺含量總體變化趨勢是溫度越高含量越高。在反應(yīng)溫度為150℃時(shí)，加熱2min后反應(yīng)體系中丙烯酰胺的濃度達(dá)到0.92mg/L，繼續(xù)加熱，體系中丙烯酰胺的濃度逐步增加，加熱8min后，反應(yīng)體系中丙烯酰胺的濃度為5.50mg/L。170℃時(shí)，情況與150℃時(shí)相似。體系中丙烯酰胺濃度隨加熱時(shí)間延長而逐步增加。加熱8min后，反應(yīng)體系中丙烯酰胺濃度達(dá)到11.36mg/L。

文獻(xiàn)［11］采用Glu/Asn摩爾比為1∶1的化學(xué)模型，在120、140、160、180℃等溫度條件下加熱不同時(shí)間(0～45min)，發(fā)現(xiàn)在加熱的開始階段，反應(yīng)體系中丙烯酰胺的產(chǎn)生量都是逐漸上升。而當(dāng)加熱到一定時(shí)間后，丙烯酰胺的產(chǎn)生量達(dá)到最高值，然后逐漸下降。高溫條件下，達(dá)到丙烯酰胺產(chǎn)生量最大值所需的時(shí)間更短。本論文所研究的加熱最大時(shí)間為8min，由圖1可見，兩種不同的加熱溫度下，8min內(nèi)丙烯酰胺的產(chǎn)生量仍處在上升階段，未達(dá)到最高值。考慮到化學(xué)模型體系的評價(jià)效率問題，本文未再深入研究加熱較長時(shí)間與反應(yīng)中丙烯酰胺的產(chǎn)生量之間的關(guān)系。

圖1 反應(yīng)溫度、時(shí)間對化學(xué)模型中丙烯酰胺產(chǎn)生量的影響Fig.1 Effect of reaction time and temperature on yield of acrylamide in chemical model

2.3.2 反應(yīng)溫度、時(shí)間對化學(xué)模型產(chǎn)物顏色的影響 當(dāng)?shù)矸垲愂称分性谳^高的溫度條件下進(jìn)行加工時(shí)，常常會(huì)伴隨著發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)。美拉德反應(yīng)對食品的感官性質(zhì)有重要影響，是其色澤和風(fēng)味的主要來源。因此，在建立化學(xué)反應(yīng)模型作為丙烯酰胺抑制劑評價(jià)體系時(shí)，不僅要考慮到化學(xué)模型中丙烯酰胺的產(chǎn)生量，還要考慮化學(xué)模型中的顏色變化，以免影響食品感官品質(zhì)。初步研究表明，產(chǎn)物的顏色會(huì)隨著加熱溫度、時(shí)間的增加逐步變深，達(dá)到最大值后基本保持穩(wěn)定，之后溫度、時(shí)間等條件對產(chǎn)物顏色的影響不明顯。因此，要使抑制劑對于產(chǎn)物顏色的影響有較明顯的體現(xiàn)，在選擇反應(yīng)體系溫度、時(shí)間時(shí)，應(yīng)盡量避免選擇產(chǎn)物顏色峰值處。本文采用樣品溶液對波長為420nm可見光的吸收來表征樣品的顏色［12］。

圖2 溫度、時(shí)間對化學(xué)模型中反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的影響Fig.2 Effect of reaction time and temperature on absorbency of chemical model production

如圖2所示，在150℃和170℃兩種不同的溫度條件下，化學(xué)模型中產(chǎn)物顏色的總體變化趨勢是隨著溫度升高而顏色加深。文獻(xiàn)［9］采用Glu/Asn摩爾比為1∶1的化學(xué)模型，研究了在150、170℃等溫度條件下不同加熱時(shí)間對反應(yīng)體系顏色的影響，結(jié)果表明，兩種溫度下，反應(yīng)體系的顏色逐漸變深;而當(dāng)加熱到約30～40min后，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度達(dá)到最高值，然后逐漸下降。由此可見，本文擬選用的加熱溫度170℃，反應(yīng)時(shí)間5min條件，得到的反應(yīng)產(chǎn)物顏色適中，未達(dá)到最大值，可同時(shí)評價(jià)抑制劑對反應(yīng)體系顏色的影響。

2.4 食品模型中反應(yīng)溫度、時(shí)間的選擇

2.4.1 反應(yīng)溫度、時(shí)間對食品模型丙烯酰胺生成量的影響 在丙烯酰胺的研究中，有學(xué)者采用薯片［13］、薯?xiàng)l［14］、餅干和面包［15］等食品作為食品模型，研究溫度、時(shí)間、抑制劑等條件對模型體系感官性質(zhì)、丙烯酰胺產(chǎn)生量的影響。鑒于油炸薯片具有容易制備、加工條件容易控制、丙烯酰胺含量相對較高等特點(diǎn)，本論文采用油炸薯片作為化學(xué)模型評價(jià)體系的補(bǔ)充手段，對經(jīng)過化學(xué)模型篩選得到的抑制劑進(jìn)行功能驗(yàn)證。

在對薯片進(jìn)行油炸的過程中，丙烯酰胺的生成量一般隨著溫度和時(shí)間的延長而增加。而當(dāng)加熱進(jìn)行到一定階段后，可能由于丙烯酰胺的聚合或者分解而使食品基質(zhì)中丙烯酰胺的生成量有所降低。本研究結(jié)果見圖3，150℃油炸條件下，2min時(shí)在薯片中丙烯酰胺的產(chǎn)生量低于方法的檢測限，之后丙烯酰胺的產(chǎn)生量隨時(shí)間延長逐漸增加，至8min時(shí)達(dá)到5.98mg/kg，而后丙烯酰胺的產(chǎn)生量呈降低趨勢。在170℃條件下，加熱6min丙烯酰胺產(chǎn)生量達(dá)到最高，之后也呈下降趨勢。在170℃、5min的條件下，薯片中丙烯酰胺的檢測含量為6.88mg/kg，含量較高且未達(dá)到最大的丙烯酰胺產(chǎn)生量，考慮到與化學(xué)模型的反應(yīng)條件相對應(yīng)，本研究中采用約2mm厚薯片，在蒸餾水或抑制劑溶液中浸泡3min后，于170℃油炸5min作為食品模型。

表2 CaCl2對化學(xué)模型和食品模型中丙烯酰胺及產(chǎn)物吸光度的影響Table 2 Effects of CaCl2on yield of acrylamide and absorbance of chemical and food model system

圖3 溫度、時(shí)間對食品模型中丙烯酰胺產(chǎn)生量的影響Fig.3 Effect of reaction time and temperature on yield of acrylamide in food model

2.4.2 溫度、時(shí)間對食品模型顏色的影響 由圖4可見，150℃條件下，油炸時(shí)間在2～8min范圍內(nèi)，薯片水提液420nm處吸光值逐漸加大，8min后薯片顏色的加深速率明顯加大。170℃時(shí)，初始階段隨時(shí)間延長薯片顏色逐漸加深，8min時(shí)吸光值增至較大值，之后保持穩(wěn)定?？梢姡?dāng)加熱時(shí)間較長時(shí)，產(chǎn)物吸光值可能達(dá)到最大值，在一定范圍內(nèi)改變油炸溫度、時(shí)間等參數(shù)不會(huì)使產(chǎn)物吸光值發(fā)生較大改變，應(yīng)避免在此條件下進(jìn)行抑制劑的篩選評價(jià)。本文所采用的條件為170℃油炸5min，產(chǎn)物吸光值適中，并未達(dá)到最大階段，可以用來進(jìn)行抑制劑評價(jià)工作。

圖4 溫度、時(shí)間對食品模型中反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的影響Fig.4 Effect of time and temperature on absorbency of food model production

2.5 化學(xué)模型及食品模型的驗(yàn)證

在丙烯酰胺抑制劑的相關(guān)研究中，CaCl2對丙烯酰胺的抑制作用得到了廣泛的證明［16］。因此，本論文中采用CaCl2溶液分別加入到化學(xué)模型和食品模型中，作為陽性對照，驗(yàn)證化學(xué)模型和食品模型對抑制劑的篩選能力，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，陽性對照品CaCl2溶液對化學(xué)模型及食品模型中丙烯酰胺有抑制作用，此結(jié)果與已有的關(guān)于CaCl2溶液對丙烯酰胺抑制作用的報(bào)道基本相符。說明本文所建立的化學(xué)模型與食品模型，可以準(zhǔn)確的評價(jià)抑制劑對于丙烯酰胺的抑制作用與抑制率。本研究的結(jié)果初步顯示CaCl2溶液的添加對于化學(xué)模型顏色無明顯影響，可能與本研究中CaCl2溶液的添加量較少有關(guān)，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文研究了不同溫度、時(shí)間及反應(yīng)物的添加量對模型中丙烯酰胺產(chǎn)生量及產(chǎn)物顏色的影響。綜合考慮丙烯酰胺生成量以及反應(yīng)時(shí)間等方面的因素，本文建立的化學(xué)模型的反應(yīng)條件為:0.050g天冬酰胺、0.060g葡萄糖加入3mL水，于不銹鋼試管中170℃油浴加熱5min。食品模型的反應(yīng)條件為:約2mm厚薯片，在蒸餾水中浸泡3min后，于170℃油炸5min。此模型簡單地模擬了丙烯酰胺在食品加工過程中的形成條件，操作便捷、穩(wěn)定，可以廣泛用于丙烯酰胺抑制劑的篩選評價(jià)，對于控制食品加工中丙烯酰胺的形成有重要意義。

目前已知的對食品加工中丙烯酰胺的形成有抑制作用的物質(zhì)有離子化合物、有機(jī)酸、植物黃酮等，由于加工工藝和食品口感等原因，尚未有成熟的抑制劑用于食品的生產(chǎn)加工過程。丙烯酰胺抑制劑的篩選還需要進(jìn)行大量的工作和深入的研究。

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